利用脱细胞半月板与软骨祖细胞构建组织工程移植物用于喉气管重建的转化研究（A Translational Approach to Airway Reconstruction Leveraging Decellularized Meniscus and Cartilage Progenitor Cells）

《Nature Communications》：A translational approach to airway reconstruction leveraging decellularized meniscus and cartilage progenitor cells

　　

每年有超过20,000名婴幼儿罹患重度声门下狭窄（subglottic stenosis, SGS），需行喉气管重建术（laryngotracheal reconstruction, LTR）以植入自体肋软骨（autologous costal cartilage）扩大气道。然而幼儿常缺乏足够体积的自体肋软骨，导致供区并发症增加、手术时间延长及气道再狭窄与二次手术风险升高。为解决上述局限，研究人员制备了一种基于猪半月板软骨脱细胞化处理的支架——命名为MENDecalized scaffold（MEND），通过选择性消化半月板中特有的弹性纤维和血管，形成利于细胞再侵入的微通道。研究表明，MEND可在3天内被耳源性软骨祖细胞（ear-derived cartilage progenitor cells, eCPCs）完全再细胞化，并于软骨诱导分化3周内达到适合植入的结构与功能成熟度，该时间窗符合临床转化要求。为进一步推进临床转化，研究人员在新西兰大白兔喉气管重建模型中验证了eCPCs-MEND移植物。结果显示，术后3个月移植物实现气道扩张、移植物上皮化、新生软骨（neocartilage）形成以及与邻近天然喉气管软骨的整合；MEND植入物在所有结局指标上均优于现行标准治疗——自体肋软骨移植，且38只实验兔均未出现移植物排出、肉芽增生、感染或钙化等不良事件。上述结果证明该组织工程喉气管重建转化策略的可行性，有望克服小儿患者自体移植相关局限，减少侵入性翻修手术需求。

该研究发表于《Nature Communications》。重度声门下狭窄（subglottic stenosis, SGS）多见于长期插管的婴幼儿，传统喉气管重建术（laryngotracheal reconstruction, LTR）需切开环状软骨并植入自体肋软骨以扩大气道，但幼儿肋软骨量不足导致供区损伤大、再狭窄率高（>24%）、翻修手术率高。现有组织工程方案——水凝胶缺乏力学强度易脱出、合成高分子引发异物反应、普通脱细胞软骨因致密基质阻碍再细胞化——均无法满足临床需求。为此研究人员提出利用猪半月板经选择性酶解去除弹性蛋白和血管制备带微通道的脱细胞半月板支架（MEN_Discal _Decellularized scaffold, MEND），联合微创获取的耳软骨祖细胞（ear-derived cartilage progenitor cells, eCPCs）构建组织工程移植物，并在体外表征及新西兰大白兔LTR模型中验证其安全性与有效性，证明其优于自体肋软骨移植，具临床转化潜力。

主要关键技术方法： 取自食品工业废弃物的猪半月板经冻融、胃蛋白酶及弹性蛋白酶（elastase）选择性消化制备MEND支架；通过组织学、DNA/糖胺聚糖（glycosaminoglycan, GAG）/胶原/弹性蛋白生化检测及压缩力学测试表征支架；从兔耳软骨经纤连蛋白（fibronectin）选择性贴壁分离培养软骨祖细胞（cartilage progenitor cells, CPCs）并做三系分化鉴定与基因表达分析；利用Transwell血清梯度法使eCPCs侵入MEND，体外软骨诱导分化3周；采用新西兰大白兔（New Zealand white rabbit）LTR模型（环状软骨+两气管环前壁纵行切开并植入移植物），设无细胞MEND、接种后MEND（Day 3）、预分化MEND（Week 3）及自体肋软骨对照组，术后3个月通过内镜、microCT、组织学、免疫组化（collagen I/II、SOX9、CD45等）、生物化学及压缩力学评估。

Enzyme-mediated meniscus decellularization yields channel-laden cartilage with conserved biochemical and mechanical properties（酶介导的半月板脱细胞化获得含微通道且保留生化和力学特性的软骨支架）： 弹性酶选择性消化去除了细胞和弹性蛋白/血管，Verhoeff Van Gieson、H&E及DAPI染色证实无残留细胞核，留下平均直径6±3 μm、沿半月板各向异性排列的微通道，占总体积约16%；糖胺聚糖（GAG）保留至原生半月板的~40%（25降至10 μg/mg），胶原含量不变，DNA降至<50 ng/mg（达到临床脱细胞标准）；动态模量不受影响，体模（bulk modulus）下降但与孔隙率增加相符，表明MEND保留了足够的生化组分与可接受力学特性并具备利于细胞侵入的微通道。

Rabbit ear cartilage progenitor cells (eCPCs) are rapidly expandable and have a robust chondrogenic phenotype（兔耳软骨祖细胞eCPCs快速扩增且具有稳定软骨表型）： 经纤连蛋白选择性贴壁从耳软骨中分离eCPCs，12天内可从103扩至10?，符合临床时间窗；三系分化显示脂/成骨潜能极低，软骨诱导后Alcian Blue强阳性且SOX9、ACAN、COL2A1显著上调，证实其具强软骨分化倾向且无钙化风险，优于间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）与软骨细胞（chondrocytes, CCs）。

eCPCs readily invade MEND within 3 days（eCPCs在3天内可完全侵入MEND）： Transwell血清梯度接种2×10?个eCPCs/scaffold，Calcein AM活细胞与DAPI横截面染色显示第3天细胞即侵入全层支架并均匀分布，达~400 cells/cm2（介于天然半月板与环状/肋软骨细胞密度），无需更长侵入时间，满足快速构建需求。

Differentiated eCPCs-MEND constructs approach both airway and costal cartilage（预分化eCPCs-MEND构建物生化与力学接近气道及肋软骨）： 接种后软骨诱导分化3周（Week 3），H&E及Safranin-O显示GAG富集基质分泌，Ⅱ型胶原（collagen II, COL II）免疫组化分布匹配肋软骨，Ⅰ型胶原（collagen I, COL I）残存于基质（源自半月板原基质）；GAG/DNA高于天然组织，总GAG干重显著增加但未完全达天然水平，体模较Day 0提升4倍，COL2A1/COL1A2比值符合透明软骨特征，表明eCPCs重塑纤维软骨基质向透明样软骨转化。

MEND integrates into and expands the airway better than costal cartilage grafts（MEND比肋软骨移植物更好地整合入气道并扩张气道）： 术中预分化Week 3 MEND具足够力学强度不塌陷（无细胞/Day 3 MEND轻度屈曲），与肋软骨相似；术后3个月内镜示所有MEND条件移植物上皮化并整合，microCT示预分化MEND新生软骨信号最强且与肋软骨相当；预分化MEND气道线性扩张率和管腔面积增大最显著（p<0.05），体内弹性模量恢复至~500 kPa（接近环状软骨），GAG含量增加；肋软骨移植物弹性模量与GAG反而下降，提示可能的活力丧失。

MEND LTR results in a significantly remodeled airway with neocartilage formation differently from costal grafts（MEND行LTR后气道明显重塑并产生新生软骨，不同于肋软骨移植物）： H&E与Safranin-O显示所有MEND条件尤其无细胞MEND可见源自切缘环状软骨的原位新生软骨长入支架，预分化组桥接最佳；肋软骨组未见新生软骨，伴纤维化组织与CD45?免疫细胞浸润、GAG丢失；免疫组化示MEND新生软骨COL I与COL II双阳性、SOX9核阳性（标志活跃软骨发生），肋软骨组SOX9阴性且无新生软骨，说明MEND本身促进局部祖细胞驱动再生。

讨论（总结）： 选择性酶消化猪半月板制备的MEND支架含利于再细胞化的微通道，联合eCPCs在3天再细胞化、3周软骨诱导达近天然气道软骨特性。兔LTR模型中38只动物零死亡，MEND各条件均实现气道安全扩张、上皮化、无排出/感染/肉芽肿，且所有MEND移植物较自体肋软骨表现出更佳整合与新软骨形成——甚至无细胞MEND也可被宿主祖细胞侵入再生，预分化eCPCs-MEND效果最优。现行水凝胶或合成材料存在力学不足或异物反应，而MEND规避了这些缺陷。eCPCs微创获取、快速扩增且不钙化，适合临床时间窗。该策略在1个月内完成细胞获取-扩增-接种-预分化，符合小儿LTR术前安排，有望克服自体肋软骨局限、降低翻修率并变革小儿喉气管重建临床实践。