SRP（Signal Recognition Particle，信号识别颗粒）调控蛋白质生物合成超出初始内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）膜靶向的范畴

《Nature Communications》：SRP orchestrates protein biogenesis beyond initial ER membrane targeting

　　

摘要：信号识别颗粒（Signal Recognition Particle, SRP）将新生蛋白靶向至Sec61转位通道以实现内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）导入。然而，其底物范围、在靶向过程中的结合时机及完整的生物学功能尚不清楚。本研究在芽殖酵母（Saccharomyces cerevisiae）中检测了SRP在翻译及膜靶向过程中与新生蛋白质组的相互作用。研究发现SRP在跨膜结构域（Transmembrane Domain, TMD）从核糖体隧道露出时即能有效结合TMD，但仅结合少数可剪切信号肽（Signal Peptide, SP）。研究人员鉴定了促进SRP结合的新生肽链特征，并据此开发了预测算法。研究表明SRP通过将新生ER蛋白分拣至不同的靶向途径及下游成熟过程而发挥功能。此外，核糖体常在易位完成前与膜解离，使得分子伴侣Ssb协助胞质域的折叠。翻译多跨膜蛋白的核糖体通过SRP与内部TMD重复结合而重新靶向至转位通道，强调了SRP与分子伴侣在膜蛋白生物合成中的协作关系。

论文解读：《SRP orchestrates protein biogenesis beyond initial ER membrane targeting》

研究背景与意义

约30%的真核细胞胞质合成蛋白需靶向至内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）以进入分泌途径，其N端通常含有可剪切信号肽（Signal Peptide, SP）或跨膜结构域（Transmembrane Domain, TMD）。经典模型认为SRP识别新生链上的靶向信号，引起翻译暂停（elongation arrest），介导核糖体-新生链复合物（Ribosome-Nascent Chain complex, RNC）与ER膜上SRP受体（SR）对接，进而停靠于Sec61转位通道完成共翻译转运。然而，SRP的真实底物谱（特别是对SP与TMD的选择性）、结合确切时机（信号完全露出前还是后）、及在多跨膜蛋白生物发生中是否仅发挥一次性初始靶向作用均存争议。例如酵母SRP可被敲除且多数SP蛋白仍可达ER，暗示替代通路存在；多跨膜蛋白翻译中核糖体是否持续结合Sec61亦不明。本文通过芽殖酵母（Saccharomyces cerevisiae）全转录组水平SRP互作谱分析，阐明SRP优先结合TMD、在信号露出隧道后结合、并通过反复结合内部TMD实现多跨膜蛋白再靶向及允许核糖体解离与分子伴侣协助折叠的新机制。该成果发表于《Nature Communications》。

主要关键技术方法

研究人员综合应用以下核糖体谱图（Ribosome Profiling, RP）衍生技术：(1) 选择性核糖体谱图（Selective Ribosome Profiling, SeRP）：用C端或N端GFP标记SRP亚基Srp54或Sec65，免疫沉淀SRP结合的RNC并测序，比对总转录组获得SRP结合谱；(2) 可溶性组分核糖体谱图（soluble-RP）：分离细胞裂解液可溶与膜结合组分核糖体，通过sigmoidal拟合计算RNC从胞质消失（膜靶向）的效率与起始点；(3) 蛋白酶K敏感性可溶性-RP（soluble-RP with Proteinase K treatment）：有限PK消化未受Sec61保护的、仅靠新生链连在膜上的RNC，区分转位通道结合态与仅靠新生链锚定态；(4) 碰撞二聚体（collided disomes）60 nt足迹分析：检测SRP结合引发的翻译减慢与核糖体碰撞；(5) 于野生型及srp54Δ（SRPΔ）、get5Δ、snd1Δ、ssbΔ等缺失株中进行上述分析，并结合生物信息学预测TMD插入自由能（ΔG_app）及信号序列疏水性评分（FILVW及PGS得分）。

研究结果

Ribosome exposure of targeting signals is critical for SRP binding（核糖体靶向信号的暴露是SRP结合的关键）

通过SeRP分析密码子分辨率下SRP富集，发现SRP在TMD或SP从核糖体出口隧道（Exit Tunnel）完全露出后，约20–25个残基暴露于溶剂时结合RNC，无信号肽合成前的SRP预招募（pre-recruitment）证据。重分析已发表数据亦支持此经典结合模型。

TMD-containing proteins are the primary substrates of SRP（含TMD蛋白是SRP的主要底物）

定量结合评分显示几乎所有含N端TMD膜蛋白（尾锚定Tail-Anchored蛋白除外）强结合SRP；而多数含SP分泌蛋白结合评分低，不依赖SRP。SRP结合偏好与TMD疏水性相关，SP若疏水核心FILVW（Phe/Ile/Leu/Val/Trp）残基数>6且无Ser/Gly/Pro破坏α螺旋则可为SRP结合。对照实验排除去垢剂、RNase处理或GFP标签造成检测偏差。

Efficient cotranslational membrane targeting of both SRP substrates and non-substrates（SRP底物与非底物均能高效共翻译膜靶向）

soluble-RP显示84%含TMD蛋白、68%含SP蛋白及94%兼含SP与TMD蛋白为共翻译ER靶向。SP蛋白虽多数不结合SRP，仍经SRP非依赖性共翻译途径到达ER膜（常延迟于SP合成后100 aa以上），仅C端信号或极短蛋白倾向翻译后靶向。

Signal peptide-containing proteins are targeted to the ER membrane by various pathways（含SP蛋白经由多种途径靶向ER膜）

srp54Δ中93% TMD蛋白丧失共翻译靶向，证明SRP依赖性；而多数SP蛋白靶向不受srp54Δ影响。67个SP蛋白分为SRP依赖（20个，h-region长且疏水）、SRP兼性（6个，结合SRP但有旁路）、SRP独立（41个，如Prc1/Gas1/Pdi1）。SRP独立SP蛋白多与Sec71相关且高频N-糖基化，暗示分选至不同转位装置。

Properties of SRP-bound signal peptides（SRP结合信号肽的特性）

SRP结合SP要求疏水区FILVW残基总数>6，并惩罚含Ser及Gly/Pro（PGS得分）。结合两标准比单纯疏水长度-评分预测更准确。人源SP与TMD疏水性亦呈双峰分布，提示该识别原则可能保守。

Targeting of SRP-independent and SRP-facultative SP-containing proteins（SRP非依赖及兼性SP蛋白的靶向）

SRP独立SP蛋白膜靶向显著迟于SRP底物。snd1Δ、get5Δ、ssbΔ缺失均未明显影响该类蛋白共翻译靶向，暗示冗余或未明胞质因子参与。

SRP binding causes translation slowdown and ribosome collisions（SRP结合导致翻译减慢与核糖体碰撞）

分析60 nt碰撞二聚体足迹发现SRP结合时下游核糖体碰撞增多，srp54Δ中减弱，表明SRP加重本征mRNA/新生链引起的翻译减慢，延长靶向窗口。标准30 nt RP未捕获此现象。

SRP skipping of N-terminal TMDs（SRP可跳过N端TMD）

多跨膜蛋白SeRP显示SRP可与后续内部TMD结合甚至跳过首TMD（尤其ΔG_app正值高即疏水性弱、难插入者，或N_cyto拓扑致链在隧道内成环延迟露出）。结合大肠杆菌数据提示N_cyto首TMD有时延迟SRP识别。

SRP repeatedly binds translocon-dissociated ribosomes for retargeting during insertion of multipass membrane proteins（多跨膜蛋白插入过程中SRP反复结合已从转位通道解离的核糖体以重新靶向）

PK敏感性实验表明翻译多跨膜蛋白时，核糖体常在环区合成期与Sec61解离（靠新生链锚定于膜），待下一TMD露出时SRP再结合促RNC重新对接转位通道；>75%核糖体于末TMD插入后、翻译终止前解离。该再靶向需SRP识别内部TMD。

Determinants of ribosome undocking（核糖体解离的决定因素）

解离发生于TMD插入后环合成约40–50 aa时，长胞质环（>100 aa）几乎必致解离；腔面膜环较少致解离。解离后胞质Hsp70分子伴侣Ssb结合RNC协助胞质域折叠（37%含长胞质环多跨膜蛋白发生）。TMD侧向扩散入脂双层产生的拉力（与ΔG_app负相关）可能促进解离，故 precede长胞质环的TMD偏向更疏水（ΔG_app更负）。

讨论与结论总结

研究人员通过三种RP方法全转录组解析酵母ER靶向，证实SRP依信号露出隧道后结合，特异地偏好TMD（疏水性阈值高）而多数SP不走SRP途径，由SRP非依赖性共翻译途径至Sec62/Sec63/Sec71/Sec72关联转位子完成，初步分选决定后续修饰（如糖基化）。多跨膜蛋白生物合成中核糖体周期性解离转位通道使Ssb等分子伴侣协助胞质环折叠，SRP通过反复识别内部TMD使RNC重新对接Sec61——SRP功能超越初始靶向，参与全程膜整合质控。未结合SRP的SP蛋白延迟靶向，可能经未明胞质网络。本研究不支持酵母中SRP无信号预装载模型。综上提出模型：SRP依新生链疏水性分拣ER蛋白——TMD/SRP→SR-Sec61-EMC(MPT)途径；SP/SRP非依赖→SEC-complex-OST-BiP途径；多跨膜蛋白经SRP反复再靶向与核糖体动态解离-分子伴侣协同完成成熟。