超临界CO2反溶剂微粉化柚皮苷和柚皮素减轻紫杉醇诱导的疼痛综合征

《Pharmaceutics》：Supercritical CO2 Antisolvent-Micronised Naringin and Naringenin Alleviate Paclitaxel-Induced Pain Syndrome

　　

**背景/目标**：紫杉醇（Paclitaxel）是一种用于治疗多种肿瘤的化疗药物，但其使用常因急性和慢性疼痛综合征而受限，目前对该疼痛综合征的管理效果不佳。柚皮苷（Naringin）及其苷元柚皮素（Naringenin）具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎和抗伤害感受（antinociceptive）作用，使其成为潜在的替代疗法。然而，它们的水溶性低限制了在人类中的口服生物利用度。在超临界介质中进行微粉化（Micronisation）可减小颗粒尺寸并增强化合物的溶出，提供了一种可能的解决方案。在本研究中，研究人员调查了是否通过超临界技术微粉化柚皮苷和柚皮素可以改善其溶出度以及对紫杉醇诱导疼痛综合征的口服疗效。**方法**：使用超临界CO₂进行微粉化。采用分子对接（Molecular docking）分析柚皮苷和柚皮素与瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1，Transient Receptor Potential Vanilloid 1，缓解疼痛的关键靶点）的结合。使用瑞士小鼠进行辣椒素（Capsaicin，TRPV1激动剂）诱导的伤害感受（nociception）以及紫杉醇引起的急性和慢性疼痛模型。研究人员评估了机械、冷和热敏感性、潜在不良效应以及TRPV1 mRNA表达。**结果**：微粉化改善了分子的表观溶出曲线。对接结果显示，柚皮苷和柚皮素与TRPV1结合。两种微粉化化合物均减少了辣椒素诱导的伤害感受，而不影响运动能力或体温。微粉化柚皮苷和柚皮素在紫杉醇诱导的急性和慢性疼痛中均减轻了机械性和冷异常性疼痛（allodynia）以及热痛觉过敏（hyperalgesia），其效果优于它们的常规形式。它们还下调了小鼠坐骨神经中TRPV1 mRNA的表达。**结论**：综合这些结果，超临界微粉化改善了柚皮苷和柚皮素的表观溶出度和口服抗伤害感受功效，强调了它们作为管理紫杉醇诱导疼痛的有前景替代疗法的潜力，其中TRPV1是观察到的抗伤害感受效应的可能贡献因素。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

全球癌症发病率持续上升，预计到2050年新发病例将达3500万。紫杉醇（Paclitaxel）是广泛用于治疗多种常见肿瘤的化疗药物，但其神经毒性可导致急性和慢性疼痛综合征，表现为机械性和冷异常性疼痛（allodynia）及热痛觉过敏（hyperalgesia），影响65–80%的化疗患者，且缺乏特异性治疗药物。柚皮苷（Naringin）及其苷元柚皮素（Naringenin）作为柑橘类水果中的黄酮类化合物，具有抗伤害感受（antinociceptive）、抗氧化和抗炎活性，但在临床前模型中口服生物利用度低，限制了其应用。超临界CO₂辅助微粉化（Micronisation）技术通过减小粒径、增大比表面积，可改善难溶性化合物的溶出行为。本研究旨在探究微粉化柚皮苷和柚皮素对紫杉醇诱导疼痛综合征的口服抗伤害感受效应，并评估瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1，Transient Receptor Potential Vanilloid 1）通道在此效应中的潜在作用。

**研究内容与结论**

研究人员采用气体反溶剂（GAS，Gas Anti-Solvent）法微粉化柚皮苷和柚皮素，通过扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、差示扫描量热法（DSC）表征颗粒性质，并在非漏槽条件下评估表观溶出度。通过分子对接（Molecular docking）分析化合物与TRPV1的结合能力。在瑞士小鼠中建立辣椒素（Capsaicin，TRPV1激动剂）诱导的伤害感受模型及紫杉醇诱导的急性和慢性疼痛模型，评估机械性、冷和热敏感性，并利用实时定量PCR（qRT-PCR）检测坐骨神经中TRPV1 mRNA表达。研究结论：超临界微粉化显著改善柚皮苷和柚皮素的表观溶出度；口服微粉化形式的化合物在紫杉醇诱导的急性和慢性疼痛综合征中表现出优于常规形式的抗伤害感受效应，且不引起运动障碍或体温变化；TRPV1通道是上述效应的可能贡献因素。该研究发表在《Pharmaceutics》。

**主要关键技术方法**

1. **气体反溶剂（GAS）微粉化技术**：在超临界CO₂（supercritical CO₂）条件下，分别以乙醇和丙酮为溶剂制备柚皮素和柚皮苷的过饱和溶液，通过控制压力和温度（柚皮素：80 bar、35 °C；柚皮苷：80 bar、45 °C）实现反溶剂沉淀，获得微粉化颗粒。颗粒由圣卡塔琳娜联邦大学（Federal University of Santa Catarina, UFSC）热力学与超临界技术实验室制备。
2. **分子对接（Molecular docking）**：使用AutoDock Vina 1.2.1和AMDock 1.5.2软件，以TRPV1晶体结构（PDB ID: 3J5P）为受体，分析柚皮苷和柚皮素与TRPV1的结合模式及自由能。
3. **辣椒素诱导的伤害感受模型及紫杉醇诱导的急性和慢性疼痛模型**：小鼠（源自巴西Chapecó地区社区大学中央动物设施）腹腔注射（i.p.）紫杉醇（急性：单次1 mg/kg；慢性：隔日1+1+1+1 mg/kg），经口服灌胃（p.o.）给予微粉化或常规化合物后，通过von Frey纤维丝、丙酮喷射和热板试验分别评估机械、冷和热敏感性。

**研究结果**

**3.1/3.2 颗粒表征**：常规柚皮素呈棱柱状结晶，平均粒径37.754 ± 22.315 μm；微粉化后变为针状，平均粒径13.370 ± 11.770 μm，XRD和FTIR证实化学结构未变，DSC显示熔点（247.94 °C vs 246.66 °C）和熔融焓（177.41 J/g vs 164.18 J/g）相近。常规柚皮苷呈不规则碎片，平均粒径22.040 ± 11.578 μm；微粉化后颗粒更均匀，平均粒径12.007 ± 6.365 μm，XRD显示微粉化后出现无定形特征，FTIR和DSC证实化学结构保留但结晶度降低（熔点144.18 °C → 131.69 °C，熔融焓62.02 J/g → 5.94 J/g）。

**3.3 溶出曲线**：微粉化柚皮素和柚皮苷在pH 1.2和pH 6.8介质中均表现出更快的初始表观溶出速率和更高的平衡浓度。重复测量ANOVA显示，柚皮素：时间、介质和颗粒类型均有显著主效应（p < 0.001），且存在交互作用；柚皮苷：时间和颗粒类型显著（p < 0.001），介质无显著影响。

**3.4 分子对接**：柚皮素与TRPV1形成氢键（GLU B:513、SER B:510、ASP B:707）、π-阳离子作用（ARG B:491）和π-π堆积（TYR B:495），结合自由能为?8.8 kcal/mol，估计抑制常数Ki = 354.46 nM。柚皮苷与TRPV1形成多个氢键（GLN B:700、SER B:512、SER B:510、ARG B:499）及π-π/π-烷基相互作用，结合自由能为?10.0 kcal/mol，Ki = 46.77 nM。

**3.5 辣椒素诱导的伤害感受**：常规柚皮苷（300 mg/kg）和微粉化柚皮苷（300 mg/kg）均减少辣椒素引起的舔爪时间（抑制率分别为45.4%和52%）；常规柚皮素无效，而微粉化柚皮素（100和300 mg/kg）有效抑制（46.2%和40.3%）。所有剂量均不影响运动能力和体温。

**3.6 TRPV1 mRNA表达**：慢性紫杉醇注射上调坐骨神经TRPV1 mRNA表达。微粉化柚皮苷（而非常规形式）显著抑制该上调（抑制率93%）；常规柚皮素完全抑制（100%），微粉化柚皮素虽未达统计学意义但呈下降趋势（60%）。

**3.7/3.8 慢性和急性疼痛模型中的机械和冷敏感性**：在慢性模型中，微粉化柚皮苷在0.5–4 h减轻机械异常性疼痛（2 h抑制50.9%），在1、2、6 h减轻冷异常性疼痛（2 h抑制62.7%）；微粉化柚皮素在1 h减轻机械异常性疼痛（25.1%），在1–2 h减轻冷异常性疼痛（2 h抑制48.8%）。常规形式仅在2 h（柚皮苷机械）或4 h（柚皮苷冷）、1 h（柚皮素冷）有效或无效。在急性模型中，微粉化柚皮苷在1–4 h减轻机械异常性疼痛（2 h抑制60.2%），在1、2、6 h减轻冷异常性疼痛（1 h抑制76.6%）；微粉化柚皮素在0.5–6 h减轻机械异常性疼痛（1 h抑制53%），在1和6 h减轻冷异常性疼痛（1 h抑制54.7%）。常规形式柚皮苷仅对冷有效（1 h），柚皮素对机械部分有效。

**3.9 热痛觉过敏**：在急性模型中，仅微粉化柚皮苷和柚皮素逆转热痛觉过敏（抑制率100%和90.5%）；在慢性模型中，仅微粉化柚皮苷有效（抑制86%）。

**讨论与结论**

研究结果表明，超临界CO₂反溶剂微粉化技术有效减小了柚皮苷和柚皮素的粒径并保持化学结构，改善表观溶出度。分子对接和辣椒素实验证实两者与TRPV1通道结合并可能作为拮抗剂，且微粉化形式下调紫杉醇诱导的TRPV1 mRNA表达。与现有研究（多采用腹腔或鞘内注射）相比，口服微粉化形式在急性和慢性疼痛模型中均表现出优于常规形式的抗伤害感受效应，涵盖机械、冷和热敏感性，且无运动或体温不良影响。这些作用可能与黄酮类化合物的抗氧化、抗炎特性及TRPV1抑制有关。研究局限性包括仅使用雄性小鼠、缺乏药代动力学数据和长期安全性评估。尽管如此，微粉化柚皮苷和柚皮素作为口服制剂在缓解紫杉醇诱导疼痛综合征方面具有潜力，且自身兼具抗肿瘤活性，尤其柚皮素因其分子较小便于优化，为化疗相关疼痛管理提供了新策略。

**结论部分翻译**：综上所述，这些结果表明超临界微粉化改善了柚皮苷和柚皮素的表观溶出度和口服抗伤害感受功效，强调了它们作为管理紫杉醇诱导疼痛的有前景替代疗法的潜力，其中TRPV1是观察到的抗伤害感受效应的可能贡献因素。