《Pharmaceutics》：Development and Characterization of a Stable Oil-in-Water Nanoemulsion Using Impingement Jet Mixing and Lyophilization Techniques
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纳米乳液（NEM）是一种针对疫苗和核酸的有效佐剂和递送系统，能够诱导针对多种病原体的免疫反应。背景/目标：传统的NEM制造采用多步骤操作，通常是高剪切均质后再进行微射流处理（HSHM），从而增加了工艺复杂性和污染风险。作为富水胶体分散体，NEM易发生微生物增殖
纳米乳液（NEM）是一种针对疫苗和核酸的有效佐剂和递送系统，能够诱导针对多种病原体的免疫反应。背景/目标：传统的NEM制造采用多步骤操作，通常是高剪切均质后再进行微射流处理（HSHM），从而增加了工艺复杂性和污染风险。作为富水胶体分散体，NEM易发生微生物增殖和液滴聚结；冷冻会进一步破坏微观结构，导致相融合和分离，因此NEM佐剂通常以多瓶形式与抗原分开储存。冷冻干燥可减少冷链依赖并实现单瓶产品，但关于冻干NEM的冻干保护剂比较和工艺优化尚无系统性研究。方法：研究人员评估了冲击射流混合（IJM）工艺作为简化、可扩展的NEM生产途径。研究人员考察了关键IJM参数，包括流速比、总流速、制备温度、微通道类型和剪切模式，以匹配传统HSHM的属性。通过动态光散射、扫描电子显微镜、透射电子显微镜、差示扫描量热法和/或体外效力对冻干和复溶后的NEM进行表征，以指导冻干保护剂选择，并采用Taguchi实验设计（DOE）方法指导冻干工艺。结果：IJM制备的NEM在液滴尺寸、多分散性指数（PDI）和形态上与HSHM相当，且具有更高通量和更少的单元操作。优化的冻干技术结合设计的冻干保护剂和工艺，形成了封闭结构以防止乳液易流动的单层发生融合，从而制备出稳健稳定的NEM。结论：将IJM与针对性冻干相结合，建立了一种可扩展、低风险的NEM制造范式，该范式保留了关键质量属性，减少了对冷链的依赖，并实现了单瓶佐剂疫苗形式，具有切实的工业和临床效益。
**研究背景、问题与目的**
水包油（O/W）纳米乳液（NEM）是疫苗及核酸递送的有效佐剂系统，通过注射部位抗原滞留（储库效应）、促炎细胞因子和趋化因子产生、损伤相关分子模式（DAMP）信号诱导以及先天免疫细胞（如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞）募集，增强免疫应答。典型NEM佐剂包括MF59、AS03和明矾稳定皮克林乳液（PAPE），阳离子纳米乳液（CNEM）可通过静电复合核酸提升细胞摄取和免疫应答。NEM（粒径约80–250 nm）具有诱导细胞和体液免疫的强能力，且粒径依赖的免疫原性效应已获验证：平均直径214±54 nm的纳米级乳液产生的抗体滴度高于相同组分、平均直径1080±360 nm的微米级乳液。然而，传统高剪切均质-微射流处理（HSHM）两步法需要多个不锈钢容器和转移管线，增加产品接触面和环境暴露风险，且开放性复杂工艺易引入RNase，导致saRNA-CNEM制剂不稳定，限制NEM作为核酸载体的应用。此外，NEM高含水量易导致微生物生长和液滴聚结，冷冻和高温均破坏其完整性。冷冻干燥可减少冷链依赖并实现单瓶剂型，但现有研究缺乏对冻干保护剂和工艺优化的系统比较。本研究首次系统探究冲击射流混合（IJM）工艺替代HSHM生产NEM的可行性，并优化MF59基及阳离子MF59衍生NEM的冻干工艺和配方，旨在建立可扩展、低风险的制造范式，同时降低冷链依赖并实现单瓶佐剂疫苗。
**主要关键技术方法**
研究人员采用基于T型接头的冲击射流混合（IJM）装置（包括两台注射泵、PEEK管和微通道），通过调节流速比（1~4:1）、总流速（63.1–137.1 mL/min）、微通道类型（T型、箭头型、Y型）、制备温度（25–60 °C）和剪切模式（对冲剪切、交叉流剪切、垂直剪切）制备NEM，并移除异丙醇（IPA）获得最终产品。利用动态光散射（DLS）分析Z-平均粒径和多分散性指数（PDI），透射电子显微镜（TEM）观察形态，高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）测定角鲨烯含量，差示扫描量热法（DSC）分析热流，扫描电子显微镜（SEM）观察冻干饼微观结构，以及Taguchi实验设计（DOE）优化冻干工艺（冷冻升温速率、一次干燥温度和升温速率作为三因素三水平）。样本来源为市售试剂，无患者队列。
**研究结果**
**3.1 IJM工艺参数设计**：通过系统研究流速比、总流速、微通道类型、制备温度和剪切模式对NEM粒径和PDI的影响，确定最优参数：流速比2.5:1、总流速137.1 mL/min、制备温度40 °C、T型微通道、垂直剪切模式。这些条件下NEM粒径约200 nm，PDI<0.2，与HSHM产品相当。
**3.2 IJM与HSHM制备NEM的对比表征与稳定性**：TEM图像显示两种工艺制备的NEM在形态和粒径分布上无显著差异。在5°C和25°C下储存1个月后，两种NEM均保持均质乳白色外观，Z-平均粒径稳定在150–190 nm，PDI<0.3，角鲨烯含量无显著变化，表明稳定性一致。研究指出IJM通过并行化可轻松放大，保留单通道局部剪切场，减少非线性放大效应。
**3.3 冻干保护剂研究**：空白NEM（无保护剂）冻干后无法形成饼状，复溶后PDI显示双峰且存在>1000 nm聚集峰。添加10%蔗糖后，一次干燥温度-25 °C使复溶后PDI降至单峰分布。通过比较蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇及其组合（不同浓度），发现含10%及以上蔗糖的单保护剂使复溶后NEM粒径降至约210 nm且PDI<0.15；海藻糖虽能形成饼形但PDI>0.4；山梨醇无法形成饼形。双组分保护剂中，10%蔗糖+1%甘露醇或10%蔗糖+2%海藻糖效果最佳。DSC分析显示保护剂与NEM间无显著分子间相互作用；SEM揭示蔗糖形成类似软木塞的封闭圆形孔结构，而海藻糖或甘露醇仅形成不连续的孔洞，解释了粒径/PDI差异。卵清蛋白（OVA）模型抗原的体外效力实验验证了这些结果，含10%蔗糖的配方效力与未冻干对照相当，而含10%蔗糖+4%山梨醇的配方效力降低（p<0.1），归因于相反转/融合导致抗原构象表位被遮蔽。
**3.4 冻干工艺参数优化**：采用Taguchi DOE设计，以PDI为响应，考察冷冻升温速率（1、2、3 °C/min）、一次干燥温度（-22、-25、-28 °C）和一次干燥升温速率（0.5、0.745、1 °C/min）。信号-噪声（S/N）比分析表明，影响PDI的因素排名为：一次干燥升温速率 > 一次干燥温度 > 冷冻升温速率。最优参数组合为一次干燥升温速率1 °C/min、一次干燥温度-25 °C、冷冻升温速率1 °C/min。
**3.5 IJM与HSHM冻干NEM的对比稳定性研究**：IJM和HSHM制备的NEM在10%蔗糖或10%蔗糖+1%甘露醇保护下冻干后，饼形完整无裂纹，5秒内复溶，残留水分均<3%。在5°C和25°C储存1个月内，Z-平均粒径、PDI和角鲨烯含量均稳定，TEM显示球形规则形态。进一步加速稳定性实验（40°C/2周）表明：未冻干CNEM粒径增至约400 nm且PDI>0.4；而采用优化保护剂（10%蔗糖、10%蔗糖+2%海藻糖、10%蔗糖+1%甘露醇）的冻干CNEM在5°C、25°C甚至40°C下1个月内粒径稳定，PDI<0.3。长期稳定性（5°C/32个月）显示，冻干NEM粒径无显著变化，而未冻干NEM出现多峰分布（聚结和Ostwald熟化）。
**总结与结论**
研究通过系统优化IJM的流速比、总流速、制备温度和剪切模式，证明IJM可生产性质与HSHM相当的NEM，且具有更低的污染风险和更易放大的优势。优化的冻干技术通过形成封闭孔结构（依赖保护剂筛选和工艺参数）防止液滴融合，使冻干NEM保持单分散性（PDI<0.2）和紧密粒径分布（200–300 nm）。DSC和SEM分析揭示了不同保护剂的作用机制：保护剂通过非共价相互作用提供物理支撑，形成适当大小的均匀孔隙以空间隔离液滴。采用Taguchi方法优化冻干工艺，确定了影响均一性的关键因素排序（一次干燥升温速率>一次干燥温度>冷冻升温速率）。稳定性数据表明，冻干样品的平均粒径和PDI在加速和长期储存条件下均优于液体配方，低残留水分限制分子扩散并抑制聚结、Ostwald熟化和聚集。结论指出，将IJM与针对性冻干结合，建立了可扩展、低风险的NEM制造范式，该范式保留了关键质量属性，减少了对冷链的依赖，并实现了单瓶佐剂疫苗形式，具有切实的工业和临床效益。研究结论部分翻译：通过系统优化流速比、总流速、制备温度和剪切模式，IJM生产的NEM在稳定性研究中表现出与HSHM相当的物理性质，表明IJM是NEM生产的有前景技术；优化的冻干技术通过形成封闭孔使冻干乳液成为可能，保护剂筛选和工艺优化使冻干NEM保持单分散性和紧密粒径分布，实验数据支持粒径/PDI作为主要评估指标，且生物活性对比验证了共冻干NEM-抗原系统的可行性；采用Taguchi方法优化冻干参数，因素影响排序为一次干燥升温速率>一次干燥温度>冷冻升温速率；稳定性分析显示冻干样品在加速和长期储存条件下保持稳定粒径和PDI，低残留水分和优化的保护层抑制了不稳定性途径；总之，本研究证明了IJM替代HSHM生产NEM的可行性，同时优化保护剂和参数将NEM转化为冻干粉末显著增强了稳定性，丰富了单剂量佐剂冻干疫苗的开发知识基础。论文发表在《Pharmaceutics》。
