Amylimycins A–C——源自海洋源解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的Bacillomycin D类似物新环脂肽

《Marine Drugs》：Amylimycins A–C, New Bacillomycin D Analogs from Marine-Derived Bacillus amyloliquefaciens

　　

： 海洋源微生物是结构多样、具有重要药学潜力的天然产物丰富来源。本研究从一株海洋源解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中分离得到三个新的环脂肽(cyclic lipopeptide)——amylimycins A–C（化合物1–3）。通过综合波谱分析及1-氟-2,4-二硝基苯基-5-丙氨酰胺(1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-alanine amide, FDAA)手性衍生化阐明了这些化合物的化学结构。Amylimycins A–C（1–3）被鉴定为属于Iturin家族的bacillomycin D类似物，特征为一个与β-氨基脂肪酸(β-amino fatty acid)残基相连接的环七肽(cyclic heptapeptide)核心。值得注意的是，这些化合物带有长度不一、不常见的支链β-氨基脂肪酸链，是bacillomycin D类似物中独特的结构特征。Amylimycins A–C（1–3）对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)表现出中等抗菌活性，而对革兰氏阴性菌株大肠杆菌(Escherichia coli)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)活性弱或无活性。

论文解读：

《Marine Drugs》刊载的该项研究针对海洋源解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)次级代谢产物中新型环脂肽(cyclic lipopeptide)的发现与结构表征开展。Bacillus属细菌可产生表面活性素(surfactin)、芬吉素(fengycin)及Iturin家族脂肽（含bacillomycin D），其中bacillomycin D由环七肽连接β-氨基脂肪酸(β-amino fatty acid)构成，已知具抗真菌及一定抗细菌活性。已有报道的bacillomycin D类似物的β-氨基脂肪酸多为直链或单甲基支链，含双甲基支链的罕见。海洋微生物能产生结构新颖的天然产物，因此研究人员从盐沼植物Suaeda maritima内生解淀粉芽孢杆菌发酵提取物中分离并鉴定了三个带有罕见双支链β-氨基脂肪酸的新bacillomycin D类似物amylimycins A–C，评价其抗菌活性并借助分子网络(molecular networking)佐证结构相关性，为发现结构新颖的微生物源抗菌先导分子提供实验依据。

主要关键技术方法：

研究人员从海蓬子(Suaeda maritima)中分离内生解淀粉芽孢杆菌W2-2（经16S rRNA鉴定，GenBank登录号PQ565561），用LB-PDB混合培养基发酵，乙酸乙酯萃取后经C18固相萃取及半制备LC-MS纯化获得amylimycins A–C；采用高分辨电喷雾电离质谱(HR-ESI-MS)及一维/二维核磁共振(NMR：¹H, ¹³C, COSY, HSQC, HMBC, ROESY, TOCSY)解析平面结构；以L-/D-FDAA（Marfey法）酸水解并衍生化测定氨基酸绝对构型；通过Global Natural Product Social Molecular Network(GNPS)平台构建MS/MS分子网络分析代谢物聚类关系；采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)评价抗革兰氏阳性菌Bacillus subtilis、Staphylococcus epidermidis及革兰氏阴性菌Escherichia coli、Pseudomonas fluorescens的活性。

研究结果：

1. 2.
   Results and Discussion
   研究人员通过HR-ESI-MS确定amylimycin A（1）分子式C₅₁H₈₀N₁₀O₁₅（[M+H]⁺m/z 1073.5885），结合¹H、¹³C及2D NMR(HSQC, COSY, HMBC, ROESY)推断出其含两个Asn、Tyr、Pro、Glu、Ser、Thr共七个氨基酸残基，通过HMBC相关确定环肽序列为Asn-1–Tyr–Asn-2–Pro–Glu–Ser–Thr，并由HMBC证实Asn-1的NH与β-氨基脂肪酸C-35相连、β-氨基脂肪酸NH与Thr C-31相连形成大环内酯键，构成与bacillomycin D类似的环脂肽骨架；HMBC信号指示β-氨基脂肪酸为3-氨基-12,14-二甲基十五烷酸(3-amino-12,14-dimethylpentadecanoic acid)。Marfey法及生物合成基因簇模块分析表明Asn-1、Pro、Glu、Thr为L-型，Tyr、Asn-2、Ser为D-型，β-氨基脂肪酸C-37构型未直接测定。Amylimycin B（2）分子式C₅₀H₇₈N₁₀O₁₅（[M+H]⁺m/z 1059.5681），NMR与1极相似仅β-氨基脂肪酸少一个CH₂，鉴定为3-氨基-11,13-二甲基十四烷酸(3-amino-11,13-dimethyltetradecanoic acid)。Amylimycin C（3）分子式C₄₉H₇₆N₁₀O₁₅（[M+H]⁺m/z 1045.5538），β-氨基脂肪酸再少一个CH₂，鉴定为3-氨基-10,12-二甲基十三烷酸(3-amino-10,12-dimethyltridecanoic acid)。GNPS分子网络中1–3聚于同一簇且具高度相似MS/MS碎片，表明共同生物合成起源及相近核心骨架，已知amylifactins A–D形成独立簇验证方法可靠性，另发现未知脂肽节点暗示存在更多类似物。MIC测定显示1–3对B. subtilis和S. epidermidis有中等抑制（革兰氏阳性敏感），对E. coli和P. fluorescens无明显抑制（革兰氏阴性不敏感），其中amylimycin A（较长脂链）活性略强，提示脂尾部结构影响抗菌效力。文末指出amylimycins A–C是少数带双甲基支链β-氨基脂肪酸的环脂肽，区别于既往多为直链或单支链的bacillomycin D类似物，凸显结构新颖性。

讨论与结论部分总结：

研究人员从海洋源B. amyloliquefaciens中分离并阐明三个新环脂肽amylimycins A–C（1–3），属Iturin家族bacillomycin D类似物，其特征为含有罕见双甲基支链的β-氨基脂肪酸(β-amino fatty acid)，此前仅见于amylifactins。三者对革兰氏阳性菌具中等抗菌活性，对革兰氏阴性菌几无作用，脂链长度差异轻微影响效价。该发现拓展了bacillomycin D类似物结构多样性，为源于海洋芽孢杆菌的抗菌天然产物研究提供新例证。