异型南五味子（Xuetong）细胞色素P450单加氧酶超家族（Cytochrome P450 Monooxygenase Superfamily in Kadsura heteroclita）的鉴定与分析

《Molecules》：Insights into the Cytochrome P450 Monooxygenase Superfamily in Kadsura heteroclita (Xuetong)

　　

摘要：异型南五味子（Kadsura heteroclita (Roxb.) Craib，俗称"Xuetong"）是一种具有抗类风湿性关节炎（RA）活性的传统土家族民族药，其主效活性成分雪通素（schizanlactone E，Xuetongsu）为环阿乔烷型四环三萜，生物合成途径尚未阐明。鉴于雪通素的生物合成可能涉及多步氧化修饰，而细胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450）是由庞大基因超家族编码的万能单加氧酶，在植物次生代谢各类氧化反应中起关键作用，研究人员对异型南五味子中的CYP450超家族进行了系统性鉴定与分析。本研究利用隐马尔可夫模型筛查并鉴定出367个KhCYP450基因，对其理化性质、系统发育、保守基序（motif）、基因结构、共线性及启动子顺式作用元件进行系统生物信息学分析。通过加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis，WGCNA）发现与雪通素积累最高的根组织显著相关的"turquoise模块"，经基因表达量与雪通素含量相关性筛选从该模块中获得32个候选KhCYP450，并通过qRT-PCR进行部分验证。其中5个候选基因经蛋白质结构比对显示与已知三萜生物合成相关CYP450具有显著同源性。本研究增进了对异型南五味子中CYP450超家族的认识，为后续雪通素生物合成研究提供了重要参考。

一、研究背景与目的意义

异型南五味子（Kadsura heteroclita (Roxb.) Craib，俗称Xuetong，血通）系五味子科（Schisandraceae）南五味子属（Kadsura）传统土家族民族药物，临床上用于祛风湿、活血通络及治疗类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）。其主效活性成分为雪通素（Schizanlactone E，Xuetongsu），属环阿乔烷型（cycloartane-type）四环三萜类化合物，具显著抗炎、镇痛及保肝低毒特性，是RA治疗的潜力先导化合物。然而Xuetongsu在植物中含量极低、化学全合成困难，且其核心生物合成途径——尤其涉及侧链C-22/C-26羟基化氧化及A-环Baeyer–Villiger氧化内酯化的步骤——尚未见报道，严重限制其开发利用。细胞色素P450单加氧酶（Cytochrome P450 Monooxygenase，CYP450）是植物中最大的酶超家族之一，介导三萜、生物碱及黄酮等次生代谢物的羟基化、氧化等修饰反应，在环阿乔烷型三萜骨架的功能基团引入中发挥关键作用。目前异型南五味子全基因组水平CYP450超家族的鉴定与分析尚属空白。该研究以异型南五味子为材料，在全基因组水平鉴定KhCYP450基因家族成员，结合多组织转录组与Xuetongsu代谢物含量关联分析，筛选参与Xuetongsu生物合成的候选CYP450基因，为阐明Xuetongsu生物合成机制奠定基础。本文发表于《Molecules》。

二、主要关键技术方法

研究人员采集野生异型南五味子6种组织（根、叶、果、树皮、木质部、花）各3次生物学重复，提取总RNA进行转录组测序获取FPKM表达量；同时采用HPLC定量各组织Xuetongsu含量。使用HMMER以Pfam CYP450结构域（PF00067）搜索异型南五味子蛋白组鉴定CYP450基因，经NCBI CDD验证后获得非冗余KhCYP450s。对其进行理化性质（ExPASy ProtParam）、亚细胞定位（DeepLoc 2.1）、跨膜结构（TMHMM）、系统进化树构建（与拟南芥AtCYP450s联合MUSCLE比对+IQ-TREE最大似然法）、保守基序分析（MEME Suite）、基因结构及染色体定位与共线性和基因复制事件分析（TBtools-II MCScanX，计算Ka/Ks）。启动子区顺式元件用PlantCARE预测。功能注释采用eggNOG（GO与KEGG）。对KhCYP450s表达矩阵进行加权基因共表达网络分析（WGCNA包，R语言），将模块与组织性状及Xuetongsu含量做Pearson相关，锁定根特异模块；对模块内基因与Xuetongsu含量做Spearman相关筛选高相关候选基因，选取部分候选基因进行qRT-PCR验证（2^-ΔΔCt法，以UBC为内参）。对验证一致的候选蛋白与UniProt已知三萜CYP450做BLAST比对，用AlphaFold3预测三维结构并比对活性中心（CASTpFold+PyMOL）。

三、研究结果

2.1. Identification of KhCYP450s（KhCYP450s的鉴定）

以HMMER筛查初获449条候选转录本，剔除可变剪接冗余并经保守结构域校验后确认367个非冗余KhCYP450基因（KhCYP450s）。蛋白长度102~1332 aa，分子量11.52~146.59 kDa，等电点pI 4.5~10.42（265个碱性，99个酸性，3个中性）。亚细胞定位预测显示281个定位于内质网（Endoplasmic Reticulum，ER，含138个跨膜蛋白和143个外周膜蛋白），36个在细胞质，1个在过氧物酶体。

2.2. Phylogenetic Analysis of KhCYP450s（KhCYP450s的系统发育分析）

将367条KhCYP450与235条拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtCYP450序列串联比对建最大似然进化树，按已发表分类体系归为9个clan：A型（CYP71 clan，247个，最大支）和非A型（CYP51/72/85/86/97/710/711/74 clans，CYP51和CYP711 clan各仅1个）。将7个已验证参与拟南芥三萜/甾醇生物合成的AtCYP450映射至树上，主要聚于CYP85 clan（1个在CYP72 clan），与部分KhCYP450亲缘较近（如AT3G50660.1/AT5G14400.1近KhCYP35269.1等；AT2G26710.1近KhCYP01968.1/KhCYP14242.1），提示这些KhCYP450可能具相似催化功能。

2.3. Conserved Motifs and Gene Structures of KhCYP450s（KhCYP450s的保守基序与基因结构）

鉴定到10个保守基序（Motif 1~10），A型CYP71 clan含全部10个，非A型缺失部分；Motif 9（ helix I，AGxDT）存在于所有clan，Motif 1含血红素结合特征序列FxxGxRxCxG（296个含此基序），Motif 6为膜锚定铰链区。基因结构显示A型外显子数少（1~8居多，总1~16），非A型（如CYP72 exon 2~18，CYP85 exon 3~10，CYP710仅1 exon）差异明显，同clan内结构相对保守。

2.4. Chromosomal Localization, Duplication Events and Synteny Analysis of KhCYP450s（KhCYP450s染色体定位、复制事件与共线性分析）

348个KhCYP450s不均匀分布于14条染色体（Chr11最多42个，Chr7最少10个）。复制类型统计：串联重复（Tandem duplication）114个（31.06%，形成62对串联对，Chr11含最多19个），全基因组复制/片段重复（WGD or Segmental duplication）42个（11.44%，19对），散布重复（Dispersed）92个（25.07%），近端重复（Proximal）87个（23.71%）。Ka/Ks比值显示绝大多数重复基因对受纯化选择（Ka/Ks < 1），仅一对Ka/Ks > 1。

2.5. Analysis of Cis-Acting Elements in the Promoter Region of KhCYP450s（KhCYP450s启动子顺式作用元件分析）

从上游2000 bp预测到74类顺式元件分8大类，光响应（G-Box等）、激素响应（茉莉酸甲酯MeJA元件在247个基因中出现）、逆境应答（缺氧响应ARE在320个中出现）及组织特异性调控元件均有分布，提示KhCYP450受光、激素、胁迫及发育阶段共同调控。

2.6. Gene Function Annotation of KhCYP450s（KhCYP450s基因功能注释）

GO注释富集代谢过程（Metabolic Process）、膜组分及催化活性条目；KEGG注释富集萜类和聚酮类化合物代谢、倍半萜和三萜生物合成（Khe27368.1同时映射至该通路）等次级代谢通路，指向KhCYP450参与三萜修饰。

2.7. WGCNA of KhCYP450s（KhCYP450s的加权基因共表达网络分析）

基于6组织转录组数据构建WGCNA，得5个共表达模块。Turquoise模块（130基因）与根组织极显著正相关（R = 0.98，p < 0.001），且Xuetongsu在根中积累最高，故选定turquoise模块为候选模块。

2.8. Verification by qRT-PCR（qRT-PCR验证）

对KhCYP450s表达量与Xuetongsu含量做Spearman相关，筛选出35个强相关基因（R > 0.75，p < 0.01），其中32个属turquoise模块（分属CYP71 n=25，CYP72 n=4，CYP74 n=1，CYP85 n=2）。随机选12个做qRT-PCR验证，5个（Khe09540.1、Khe19353.1、Khe19975.1、Khe21316.1、Khe23791.1）RNA-seq与qRT-PCR极显著一致（R²> 0.9），另3个中等相关，4个无一致性。最终将表达稳定一致的8个基因视为Xuetongsu生物合成潜在候选基因。

2.9. Analysis of Protein Structure（蛋白质结构分析）

对8个稳定候选蛋白BLAST比对UniProt，5个与已表征三萜CYP450高度同源：Khe19353.1（CYP71BQ17同源，66.3%一致）、Khe23791.1（CYP71BQ5同源，63.9%）、Khe09540.1（CYP72A154同源，65.6%）、Khe21316.1（CYP93E1同源，61%）、Khe22992.1（CYP71CD4同源，62.7%），E值均< 1×10^-100。AlphaFold3建模pTM 0.87~0.93，QMEANDisCo > 0.6，Ramachandran有利残基96.96%~99.22%。活性口袋比对显示Khe09540.1与CYP72A154、Khe21316.1与CYP93E1空间重叠率高（分别为81.82%、74.41%）且中心距<10 ?，提示催化活性保守；Khe22992.1与CYP71CD4中等保守；Khe19353.1/Khe23791.1活性口袋偏移较大（重叠率<30%），暗示底物特异性可能分化。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，异型南五味子鉴定到367个KhCYP450基因，多于柑橘（301）、水稻（326）、桂花（276）和红豆杉（293），CYP71 clan最大（247个），基因家族扩张可能支撑其三萜多样性合成。保守基序分析证实KhCYP450含典型血红素结合基序（Motif 1 FxxGxRxCxG）、Helix K（Motif 2 ExxR）、Helix C（Motif 5 WxxxR）及膜锚定区（Motif 6），A型与非A型基序分布差异符合进化假说。启动子区广泛存在MeJA响应元件，与MeJA可诱导三萜合成基因表达相符，提示KhCYP450参与Xuetongsu生物合成调控。候选基因富集于CYP71 clan（与拟南芥甾醇合成CYP85/CYP72偏好不同，体现谱系特异性），5个候选与已知三萜CYP450同源（CYP72A154催化齐墩果烷型C-30三步氧化、CYP93E1催化C-24羟化、CYP71CD4催化C-23羟化与C-24,25环氧化、CYP71BQ17/BQ5催化C-21羟化），其中Khe09540.1、Khe21316.1、Khe22992.1活性口袋保守度高，功能较可能保守；Khe19353.1与Khe23791.1虽整体折叠保守但口袋位移，预示新底物特异性。因候选基因与已报道C-22/C-26羟化酶亲缘较远（底物骨架不同：cycloartane vs oleanane/tirucallane vs sterol），确切功能需异源表达或基因编辑验证。研究局限含未做体外酶活及体内转基因验证、低表达/弱相关基因可能被漏筛。

结论（Conclusions）翻译如下：

本研究在异型南五味子中鉴定出367个CYP450基因，归为9个clan。聚于CYP71、CYP72和CYP85 clan的KhCYP450s更可能参与三萜修饰。数个关键基因——包括Khe09540.1、Khe21316.1和Khe22992.1——与已表征的三萜生物合成CYP450具高序列同源性且活性中心结构保守，提示其在Xuetongsu生物合成三萜骨架氧化修饰中可能发挥催化作用。总之，本研究深化了对异型南五味子CYP450超家族的认识，并为阐明Xuetongsu生物合成机制奠定了基础。