《Molecules》：In Vitro Evaluation of Novel Nano-Sized Colloidal Assemblies Incorporating Hydrophobic Tobramycin Ion Pairs: Enhanced Cellular Uptake with Preserved Antimicrobial Activity Toward Oral Drug Delivery
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妥布霉素是一种高度亲水性的氨基糖苷类抗生素，细胞通透性有限且口服生物利用度可忽略，因此需要经胃肠外给药。本研究旨在开发基于纳米级胶体组装体（NCA）的药物递送系统，通过引入妥布霉素离子对以提高其亲脂性、向口服给药途径转化的潜力及其抗菌活性。研究人员将妥布霉素分
妥布霉素是一种高度亲水性的氨基糖苷类抗生素，细胞通透性有限且口服生物利用度可忽略，因此需要经胃肠外给药。本研究旨在开发基于纳米级胶体组装体（NCA）的药物递送系统，通过引入妥布霉素离子对以提高其亲脂性、向口服给药途径转化的潜力及其抗菌活性。研究人员将妥布霉素分别与油酸、月桂酸和荧光素进行离子配对，并采用Tween 80、二甲基亚砜（DMSO）和丙二醇的组合制备NCA预浓缩物（F1–F5）。所得制剂经稀释后形成稳定纳米液滴，粒径为9.50–16.30 nm，粒径分布窄（多分散指数；PDI < 0.3），且具有中等负ζ电位（?4.99至?11.13 mV）。体外释放研究表明，与游离妥布霉素的快速释放相比，离子配对体系表现出持续释放特征。Caco-2细胞中的细胞毒性评价显示，在1:10,000和2:10,000稀释度下具有较高生物相容性，而较高剂量下呈现浓度依赖性毒性，提示细胞内递送增强。细胞摄取研究显示，F1–F3制剂的妥布霉素内化显著升高（p < 0.001），摄取值为81.76–96.14%，而游离药物显示为零或可忽略不计的摄取。荧光素标记制剂（F4和F5）进一步证实摄取增强，表现出强烈的细胞内荧光。该结果得到目视观察、紫外-可见吸收（UV–Vis，分别为阳性对照的70.5–84.8%）及共聚焦显微成像的支持。针对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）的抗菌活性方面，在稀释介质中使用相同妥布霉素浓度时，F1–F5与游离妥布霉素相当（抑菌圈16–18 mm）。上述发现证实，所制备NCA在促进妥布霉素细胞内递送的同时，能够保持生物相容性及相近的抗菌活性。此外，荧光素的摄取为类似离子配对制剂中妥布霉素内化增强提供了间接证据。该策略有望克服肠道屏障并改善口服生物利用度，从而可能实现妥布霉素由胃肠外给药向口服给药的转变。
该论文发表于《Molecules》，围绕高极性抗生素妥布霉素口服递送难题展开，核心目标是通过制剂工程提升其细胞摄取与潜在肠道转运能力，同时不削弱原有抗菌效应。研究背景在于，口服给药因无创、便利、依从性高而具有显著优势，但其成功依赖药物溶解性、胃肠道稳定性与肠上皮通透性之间的平衡。妥布霉素作为典型氨基糖苷类抗生素，属于生物药剂学分类系统（BCS，按溶解性与肠通透性划分药物吸收特征的体系）III类候选药物，具有高水溶性、低膜通透性特征。其分子含多个可离子化氨基，极性强、亲脂性极低，难以通过肠道脂质膜被动扩散；同时，肠黏液层、上皮紧密连接及外排转运机制也进一步限制其经口吸收。因此，如何在不改变药物骨架结构和抗菌机制的前提下，增强其与脂质环境的相容性并提高细胞摄取，是该研究开展的直接原因。
研究人员据此提出将疏水性离子缔合（HIP，通过可逆静电作用降低高极性药物表观极性）与纳米级胶体组装体（NCA，由表面活性剂/助溶剂自组装形成的纳米胶体递送体系）相结合的策略。研究选取油酸、月桂酸及荧光素作为反离子，与妥布霉素构建离子对，并进一步装载入以Tween 80为核心、辅以DMSO或丙二醇的纳米递送体系中。研究结论表明，该类NCA可在维持纳米级粒径、短期胶体稳定性和较高生物相容性的同时，显著提高妥布霉素在Caco-2细胞中的内化水平，并保持对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性。其重要意义在于，为高亲水性、低渗透性抗生素的口服纳米递送提供了可行的体外概念验证，也为妥布霉素由注射给药向口服制剂转化提供了实验基础。
作者开展研究所采用的关键技术方法主要包括以下几类。首先，利用等电荷配比的反离子在DMSO中与妥布霉素形成HIP复合物，并通过冻干获得固体离子对。其次，依据处方组成制备F1–F5预浓缩体系，稀释后形成纳米液滴，并采用动态光散射（DLS）测定粒径、多分散指数和ζ电位。再次，使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）验证离子对形成，采用高效液相色谱（HPLC）定量妥布霉素并评估体外释放。随后，以University of Jordan提供的人结直肠腺癌Caco-2细胞为模型，开展MTT细胞毒性实验、细胞摄取实验，并结合荧光素示踪、紫外-可见分光（UV–Vis）和共聚焦显微镜进行验证。最后，以ATCC标准菌株P. aeruginosa ATCC 9027、S. aureus ATCC 29213和MRSA ATCC 43300进行纸片扩散抑菌试验。
在研究结果部分，论文首先在“2.1. Characterization of the Developed NCAs”中指出，F1–F5在1:100稀释后均形成9.50–16.30 nm的纳米液滴，PDI均低于0.3，24 h内粒径变化较小，提示体系分散均一且具有良好短期稳定性。研究人员据此认为，较小粒径有利于黏液层扩散、增强与上皮表面的接触并促进内化。与此同时，各制剂ζ电位介于?4.99至?11.13 mV之间，显示中等负电表面电荷。F1和F2较非离子配对体系具有更负的ζ电位，说明脂肪酸反离子的引入改变了界面特性并部分屏蔽妥布霉素阳离子氨基。论文进一步指出，体系稳定性主要依赖Tween 80带来的空间位阻稳定，而非高绝对值静电排斥。
在“2.2. Fourier Transform Infrared (FTIR) Analysis”中，研究人员通过混合过程中出现的沉淀、浑浊和颜色变化，初步判断离子对形成；进一步FTIR结果显示，妥布霉素在3200–3500 cm
?1处的OH/NH伸缩振动带以及脂肪酸在1700–1720 cm
?1处的羰基峰发生减弱和展宽，提示妥布霉素质子化氨基与羧酸/羧酸盐之间存在静电相互作用。未见新共价键特征峰，表明形成的是非共价复合物，且妥布霉素结构未被破坏。
在“2.3. In Vitro Drug Release”中，研究人员发现处方组成显著影响释放行为。F1和F2作为HIP体系，在15 h时累计释放分别为99.27%和98.76%，表现为前3 h适度初始释放后持续缓释；而未离子配对的F3在前3 h即释放约71.79%，表现出明显突释。F4和F5的15 h累计释放为89.74%和88.98%，释放更慢。由此可见，HIP可通过增强药物与载体的结合降低早期扩散性损失，同时并不阻碍最终药物释放完成。
在“2.4. Cytotoxicity Assessment in Caco-2 Cells”中，MTT结果显示空白制剂在1:1000、1:10,000和2:10,000稀释下均保持高细胞活力，说明辅料本身毒性较低；而含药制剂在1:1000时细胞活力降至约37%–63%，且显著低于相应空白组，体现明显浓度依赖性细胞毒性。游离妥布霉素在相同浓度下则基本不致毒。研究人员据此认为，毒性主要源于制剂促进妥布霉素进入细胞后的细胞内暴露增加，而非细胞外游离妥布霉素或辅料本身作用。这一结果从侧面支持所构建NCA具有提升细胞摄取的能力。
在“2.5. Cellular Uptake Studies”中，研究人员采用HPLC检测Caco-2细胞裂解液内妥布霉素含量，发现F1、F2和F3在2:10,000稀释、孵育5 h后，细胞摄取率分别达96.14 ± 3.85%、89.74 ± 1.89%和81.76 ± 4.32%，均显著高于游离妥布霉素，后者几乎检测不到摄取。结果表明，NCA显著增强了妥布霉素跨膜内化。F1和F2表现优于F3，说明脂肪酸离子配对提高表观亲脂性后，更有利于与细胞膜脂质结构相互作用并增强转运；同时Tween 80和丙二醇等辅料也可能通过提高膜流动性促进跨细胞摄取。
在“2.6. Fluorescein-Based Uptake Validation: UV–Vis and Confocal Evidence”中，F4和F5作为荧光素标记体系被用于进一步验证摄取行为。细胞裂解液呈现明显绿色，UV–Vis在约490 nm处有强吸收，F4和F5相对于阳性对照的摄取率分别约为84.8%和70.5%。共聚焦显微镜进一步显示细胞内存在强荧光信号，说明纳米体系确实发生了显著细胞相关摄取。由于完成孵育后进行了充分洗涤，因此检测信号主要代表细胞相关内化，而非细胞外残留。该部分结果与F1–F3的HPLC定量结果相互印证，为妥布霉素经类似离子对体系实现高效内化提供了间接支持。
在“2.7. Antibacterial Activity Assay”中，研究人员采用纸片扩散法评价F1–F5的抗菌活性。针对P. aeruginosa ATCC 9027，所有含药制剂均形成清晰抑菌圈，直径约17–18 mm，与游离妥布霉素相当；空白制剂无抑菌圈，说明活性来源于妥布霉素本身。针对S. aureus ATCC 29213，各制剂同样保持可测抑菌活性，抑菌圈约15–17 mm，总体与游离药物接近，提示制剂化过程未削弱对该菌株的抑制作用。对于MRSA ATCC 43300，各制剂及游离妥布霉素均未观察到可见抑菌圈，说明该递送体系并未扩展妥布霉素的抗菌谱，也未赋予其对MRSA的可检测活性。综合来看，NCA显著改善了细胞递送，但并未改变药物既有抗菌谱，关键优点在于“增强递送而不损伤活性”。
讨论部分的核心在于，HIP与NCA联合策略通过调控药物表观亲脂性、纳米粒径、界面性质和释放动力学，成功解决了妥布霉素“高溶解、低渗透”的主要制剂矛盾。论文反复强调，增强的细胞摄取来自离子配对与纳米自组装体系共同作用，而非单纯提高浓度；同时，生物相容性窗口的存在表明可通过稀释度调节细胞暴露与毒性之间的平衡。研究也明确指出，当前证据仍限于体外层面，未来仍需跨上皮转运、跨上皮电阻（TEER）及体内研究进一步证实其口服应用价值。尽管如此，本文已经完成了从材料设计、理化表征、释放行为、细胞安全性、摄取能力到抗菌功能保存的系统论证，形成了较完整的概念验证链条。
研究结论部分可译为：本研究成功开发并系统评价了负载妥布霉素离子对的纳米级胶体组装体（NCA）。所得制剂（F1–F5）具有纳米级液滴粒径（9.50–16.30 nm）、分布较窄的胶体稳定性（PDI < 0.3）以及中等负ζ电位（?4.99至?11.13 mV），表明其与妥布霉素伯氨基之间存在有效离子相互作用，并适于与细胞发生相互作用。药物释放研究表明，离子配对体系表现出持续释放特征，而游离妥布霉素制剂释放更快。重要的是，所有制剂在适当稀释度（1:10,000和2:10,000）下均表现出较高生物相容性，维持接近完全的细胞活力；而较高剂量下出现的浓度依赖性细胞毒性则证实了其有效的细胞内递送。细胞摄取研究显示，与几乎无摄取或不可检测摄取的游离药物相比，所研究NCA可显著增强妥布霉素内化（p < 0.001）。这一点通过F1–F3的HPLC分析得到定量证实，并通过F4和F5的荧光素追踪得到进一步支持。后两者表现出强烈的细胞内荧光，既可在裂解液中直观看到，也得到较高UV–Vis吸收值（为阳性对照的70.5%–84.8%）及共聚焦显微成像的支持。F4和F5中荧光素的大量摄取，进一步为采用油酸和月桂酸构建的类似离子配对体系中妥布霉素的高效细胞内递送提供了间接证据。抗菌评价进一步证实，所有含妥布霉素制剂（F1–F5）均保持了强效抗菌活性，对P. aeruginosa和S. aureus的抑菌圈与游离妥布霉素相当；而相应空白制剂无可检测活性，证实抗菌效应完全归因于妥布霉素。上述结果表明，离子配对与NCA制剂化并未削弱妥布霉素固有的抗菌效力，却赋予其更优的递送特性。总体而言，所开发NCA通过离子配对及通透性增强型辅料的联合应用，有效提高了妥布霉素的细胞摄取，兼具功能有效性与处方设计合理性。这些发现提示，该递送策略有望克服妥布霉素吸收过程中相关生物屏障，同时最大程度维持其抗菌活性，因此为未来旨在提高口服生物利用度、推动妥布霉素治疗由胃肠外给药向口服给药转化的体内研究提供了有前景的平台。
