基于定量脂质组学揭示不同发育阶段樟（Cinnamomum camphora）种仁的动态脂质谱

《Plants》：Quantitative Lipidomics Reveals Dynamic Lipid Profiles in Cinnamomum camphora Seed Kernels at Different Developmental Stages

　　

基于定量脂质组学揭示不同发育阶段樟（Cinnamomum camphora）种仁的动态脂质谱。樟（Cinnamomum camphora）种仁是一种潜在的有价值的脂肪酸油资源；然而，其脂质组成及发育过程中的动态变化尚不清楚。本研究结合形态解剖学观察与基于液相色谱-串联质谱（liquid chromatography–tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）的脂质组学技术，探究了樟树种仁在五个发育阶段的脂质积累模式。结果显示，种子发育遵循形态成熟先于生理成熟的独特模式。研究共鉴定并分类出627种脂质分子，归属于27个亚类和5个主要类别。其中，甘油酯类（glycerolipids, GLs）和甘油磷脂类（glycerophospholipids, GPs）为优势脂质类别，而三酰甘油（triacylglycerols, TGs）是主要的储存脂质。约84.2%的检测脂质为不饱和脂质，表明其脂质谱高度不饱和。脂肪酸组成富含中链脂肪酸（medium-chain fatty acids, MCFAs），尤其是癸酸和月桂酸，表明樟树种仁油相比传统脂肪酸油具有独特的组成特征。此外，辅酶Q（coenzyme Q, CoQ）在种子发育过程中表现出相对较高的丰度和动态积累。差异脂质分析进一步揭示，脂质重塑主要发生在发育早期阶段，且与甘油酯和甘油磷脂代谢显著相关。二酰甘油（diacylglycerols, DGs）、磷脂酰胆碱（phosphatidylcholines, PCs）和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamines, PEs）在早期发育阶段下降，而TGs从中期开始持续积累。总体而言，本研究系统表征了樟树种仁的脂质组成及发育动态，为其未来作为新型功能性脂肪酸油资源的开发利用提供了理论基础。

樟（Cinnamomum camphora）作为樟科（Lauraceae）樟属的常绿乔木树种，其种仁是一种具有显著开发潜力的特色脂肪酸油资源。该物种种子在中国年产逾百万吨，种仁含油率介于46.29%至62.08%之间，均值超过50%，被广泛视为一种来源广泛、成本低廉且可再生的油脂原料。樟树种仁油以富含中链三酰甘油（medium-chain triacylglycerols, MCTs）为特征，含有丰富的辛酸（C8:0）、癸酸（C10:0）、月桂酸（C12:0）及肉豆蔻酸（C14:0）。与长链脂肪酸相比，这类脂肪酸更易被人体吸收代谢，能更高效地提供能量，在调节糖脂代谢、限制脂肪积累及开发增值功能性油脂方面展现出重要应用前景。此外，樟树种仁油已被证实安全无毒，其产品符合相关食用及药用标准，凸显了其作为新型功能性油脂的潜力。

脂质作为不溶于水但易溶于非极性有机溶剂的有机化合物，在营养运输、能量转化、信号转导及代谢调控中具有不可或缺的作用。根据LIPID MAPS分类系统，脂质可分为脂肪酸（fatty acids, FAs）、甘油酯类（glycerolipids, GLs）、甘油磷脂类（glycerophospholipids, GPs）、鞘脂类（sphingolipids, SPs）、甾醇脂类（sterol lipids, STs）、糖脂类（saccharolipids, SLs）、异戊烯醇脂类（prenol lipids, PRs）及聚酮类（polyketides, PKs）八大类别。脂质组学作为全面分析脂质组成、识别差异丰度脂质分子及阐明脂质代谢调控的重要途径，已广泛应用于油籽作物品质研究中。其中，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）凭借高效分离与可靠鉴定复杂脂质混合物的能力，在植物脂质组学研究中占据核心地位。

尽管已有研究关注了樟树种仁脂肪酸组成的区域变异，但其脂质组学特征尚未得到系统表征，尤其缺乏涵盖整个发育时期的动态脂质重塑数据。种子脂质代谢是一个高度动态且有序调控的过程，脂质的持续生物合成、积累及结构重塑深刻决定了成熟种子油的物理品质、营养特性及工业加工性能。相较于常规油籽植物，樟树表现出独特的异步发育特征，即种子形态成熟早于生理成熟，伴随显著的脂质代谢重编程。鉴于此，研究人员开展了樟树种仁发育进程研究，采用LC-MS/MS脂质组学技术表征其脂质组成及跨发育阶段的动态积累模式，以期为阐明樟树种子油脂形成机制及开发新型功能性油脂提供理论支撑。

本研究样品来源于中国江西省南昌市乐华镇约15公顷的同质无性系 plantations中筛选出的3株健康且生长一致的母树，该无性系具有相同遗传背景，场地条件、土壤性质及微环境高度一致。研究人员于2025年4月下旬至10月下旬，覆盖总计183天的种子发育周期进行采样，每个发育阶段从每株母树四个方位采集30粒饱满种子混合为一个复合样品，设置三个技术重复用于后续分析。

研究首先通过石蜡切片技术观察种子形态解剖学变化。依据果实发育特征，将种子发育划分为五个阶段：S1幼果期（开花后7–32天）、S2果实膨大期（32–81天）、S3种仁形成期（81–102天）、S4种仁成熟期（102–171天）及S5果实完熟期（≥171天）。形态观察发现，樟树种子发育呈现形态成熟先于生理成熟的独特模式：果实膨大、种皮分化及内果皮木质化在81天前基本完成，而胚分化及子叶形成直至81–102天才明显出现；种仁大小和油脂含量在外部果实形态稳定后仍持续增加，种子成熟、脱水及储备积累于10月中旬完成。

基于LC-MS/MS的脂质组学分析共鉴定出627种脂质分子，归属于5个主要类别、27个亚类，包括377种GLs、169种GPs、56种SPs、3种PRs及22种FAs。其中GLs和GPs为优势脂质类别，TGs是GLs中的主要成分，而GPs包含多个主要及少量次要亚类。值得注意的是，CoQ是PR类别中唯一检测到的脂质。质控样品（QC）的总离子流色谱图（total ion chromatograms, TICs）显示良好的谱图重叠，保留时间稳定，峰强度一致，证实LC-MS系统校准良好且运行稳定。

K-means聚类分析将鉴定脂质分为8个聚类（Clusters 1–8），揭示出明显的阶段依赖性变异。Cluster 1富集GLs、GPs、SPs和FAs，以GPs和GLs为主，提示早期膜脂合成活跃且随种仁成熟逐渐下降；最大的Cluster 5从S1到S2急剧下降后维持低水平，主要含各类GPs和SPs，暗示信号脂质和膜脂前体在种子发育初期被快速代谢利用；Cluster 7呈典型V型模式，主要由神经酰胺（ceramide, Cer）组成，可能参与中期发育调控和应激响应；Cluster 8在S3降至最低后逐渐上升，富集含亚油酸（linoleic acid, 18:2）、癸酸（10:0）、月桂酸（12:0）及CoQ₉的脂质组分，与樟树种仁生理成熟过程及功能脂质后期积累特征高度一致。

定量分析显示，FA在S1相对丰度最高后迅速下降并保持低水平；GL从S1至S5逐渐积累，尽管S1至S2间有短暂下降，后期成为优势脂质类别；GP总体呈下降趋势，中期达最低后部分恢复；SP和PR始终维持低水平无显著变化。亚类水平上，TGs在S1至S2下降后从S2至S5持续增加，与GL总体积累模式一致；DGs从S1至S2下降后维持极低稳定水平；PEs从S1至S3显著下降后于S4部分恢复；PCs总体呈下降趋势；PIs从S1至S2下降、S2至S4上升后稳定于较高水平；CoQ在各阶段保持相对较高丰度。不饱和脂质分析表明，约84.2%的脂质为不饱和脂质，双键数主要介于1至9个，含1、2或3个双键的脂质占比最大，显示樟树种仁脂质谱高度不饱和。

主成分分析（principal component analysis, PCA）显示PC1和PC2分别解释74.71%和13.48%的总方差，生物学重复样品聚类紧密，不同发育阶段样品明显分离。变异系数（coefficient of variation, CV）分析表明超过75%的脂质特征CV值低于0.3，分析稳定性和技术重复性良好。差异脂质分析发现，S1 vs. S2比较包含最多差异脂质（451种，50种上调、401种下调），早期发育转变发生最广泛的脂质组重塑；S4 vs. S5差异脂质最少（26种）。KEGG通路富集分析显示，S1 vs. S2中GL代谢和肌醇磷酸代谢最显著富集；S2 vs. S3主要为GP代谢、代谢途径及次级代谢产物生物合成；S3 vs. S4主要为花生四烯酸代谢、亚油酸代谢及α-亚麻酸代谢；S4 vs. S5以亚油酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成及花生四烯酸代谢富集最强。

针对TGs、DGs、PEs和PCs四个代表性亚类的动态变化分析揭示：DGs在S2/S1和S3/S2中主要下调（分别占91%和82%），随种子成熟下调比例逐渐降低；PCs在S2/S1和S4/S3中主要下调，但在S3/S2中主要上调；PEs在早期发育阶段主要下调，后期丰度显著降低；TGs在S2/S1和S3/S2中强烈上调（S2/S1中72%上调、11%下调），S4/S3转向下调，与TG总丰度发育模式一致。脂肪酸组成分析显示，TGs中饱和脂肪酸（saturated fatty acids, SFAs）、单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acids, MUFAs）和多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFAs）分别占44.71%、27.38%和28.45%，不饱和脂肪酸总计占65.83%，以棕榈酸（16:0, 36.12%）、油酸（18:1, 52.17%）、亚油酸（18:2, 46.03%）和亚麻酸（18:3, 28.45%）为主，并含癸酸、月桂酸等MCFAs。DGs、PCs和PEs亦表现出高不饱和特征，不饱和脂肪酸分别占58.69%、64.29%和67.08%。

讨论部分，研究人员首先指出樟树种子胚发育明显滞后于果实形态建成和种皮硬化，与薄壳山核桃（Carya illinoinensis）和油茶（Camellia oleifera）等其他油籽物种存在差异，这种形态成熟先于生理成熟的发育程序具有独特性。系统脂质组学分析鉴定出627种脂质分子，脂质多样性较高，GPs的相对丰富和多样性尤为突出，为食品、医药及个人护理行业提供了潜在的功能性脂质和天然乳化剂来源。

约84.2%的脂质为不饱和脂质，这一高度不饱和特征有助于维持细胞膜流动性和结构完整性，适应种子成熟、脱水及环境温度波动。脂肪酸组成上，樟树种仁油富含MCFAs（尤其是癸酸和月桂酸），具有区别于传统油籽作物的独特中链脂质谱。MCTs与快速能量供应、体重及血糖代谢调控相关，且樟树种仁油在室温下呈液态，脂肪酸组成更为均衡。GLs占总脂质的60.13%，TGs占44.66%，证实GLs作为油籽主要储存脂质的功能。CoQ的动态积累模式（早期快速增加、中晚期逐渐下降后维持稳定）与其在线粒体呼吸链电子传递、ATP合成及抗氧化保护中的角色一致，其含量与开心果和花生相当，高于豆类和油菜等传统油籽作物，使樟树种子成为可持续的天然CoQ来源。MCFAs与较高CoQ水平的共存可能有助于提升脂质抗氧化能力和种子寿命。

Kennedy通路阐释了脂质代谢重编程：酰基辅酶A（acyl-CoA）依次进入溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid, LPA）、磷脂酸（phosphatidic acid, PA）和DG生物合成，DG作为关键代谢枢纽分流至储存脂质TGs和膜磷脂PCs/PEs。发育变化揭示时间通量转换：早期优先合成PCs/PEs用于膜生物发生，中晚期偏向TG积累。TGs富集MCFAs（C10:0、C12:0），而PCs/PEs含更多长链/不饱和物种（C16:0、C18:1、C18:2），这种差异反映酶底物偏好性，与DGAT和PDAT的底物选择性一致。DGs在S1的高丰度反映早期活跃脂质合成，S2至S5的急剧下降表明其向TGs的快速转化，发挥脂质转换中的过渡作用。

动态脂质变化与油脂品质、营养及脂质积累机制密切相关。MCFAs从S3逐渐增加至S5达峰，占脂质总量10–15%，与种子成熟同步，促成MCT富集油脂形成。游离脂肪酸（free fatty acids, FFAs）在S2后维持1–2%的低水平，有利于油脂提取。GPs（包括PEs、LPCs和LPEs）在S5维持极低水平，避免对油脂风味产生不良影响，反映樟树种仁油的高食用品质。从S1至S2的DGs、PCs和PEs下降表明从膜脂合成向储存脂质积累的 metabolic transition，得到GL和GP通路KEGG富集的支持。S2至S5的持续TG积累伴随低PC和PE水平，提示DGs通过DGAT途径转化为TGs，而PCs和PEs作为酰基供体参与脂质重塑。综合S5最高的MCT积累、低FFA含量及最少磷脂 abundance，研究人员推测S5可作为适宜收获窗口期，以最大化MCT富集并保持油脂最优风味和营养特性。

研究同时 acknowledges 若干局限：未能追踪单半乳糖二酰甘油（monogalactosyldiacylglycerol, MGDG）和二半乳糖二酰甘油（digalactosyldiacylglycerol, DGDG）水平下降过程中脂肪酸酰基的代谢命运；五个时间点的采样间隔较长且不均匀，无法拟合标准S型动力学曲线，难以区分脂质生物合成、降解和相互转化；未调查种子储存期间脂质组成和含量的变化，限制了对采后油脂品质稳定性的理解。未来研究应系统分析采后储存条件对油脂品质的影响，采用代谢通量分析或酶活性测定等整合方法阐明GL衍生脂肪酸的精确代谢命运，并采用更密集的时间进程采样（如每7–10天）结合代谢示踪技术进行严格动力学分析，同时动态监测单粒生物量及绝对脂质定量以深入揭示脂质重塑模式。

研究结论部分指出，本研究采用LC-MS/MS系统表征了樟树种仁在五个发育阶段的脂质组学特征及动态积累模式。结果显示种子发育遵循形态成熟先于生理成熟的独特模式。共鉴定627种脂质分子，脂质谱特征为高度不饱和，GLs为优势脂质类别，TGs为主要储存脂质。脂肪酸组成富含MCFAs，特别是癸酸和月桂酸。种仁积累了相对丰富且稳定的CoQ，凸显其潜在营养和抗氧化价值。差异脂质主要集中在早期发育阶段，显著富集于GL和GP代谢通路。DGs、PCs和PEs在早期发育中下降，而TGs从中期开始持续积累。具体而言，MCFAs从S3逐渐增加至S5达峰，CoQ呈早期增加后逐渐下降的模式，与其能量供应和抗氧化保护作用一致。总体而言，本研究阐明了樟树种仁的脂质积累模式和代谢特征，为其未来作为新型功能性脂肪酸油资源的开发提供了基础。