《Diagnostics》：Virtual Evaluation of Hematoxylin & Eosin via Digital Pathology Survey (VEED) Project: Results from a Non-Inferiority Study of a Tabs-Based Staining Method
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背景/目的：尽管苏木精和伊红（H&E）染色仍是组织病理学诊断的基石，但实验室内部及实验室间仍存在显著变异。这一问题在数字病理学中愈发突出，因为染色不一致可能影响全切片图像（WSI）判读及图像分析算法性能。在本研究中，研究人员评估了一种新型基于片剂的H&E组织化
背景/目的：尽管苏木精和伊红（H&E）染色仍是组织病理学诊断的基石，但实验室内部及实验室间仍存在显著变异。这一问题在数字病理学中愈发突出，因为染色不一致可能影响全切片图像（WSI）判读及图像分析算法性能。在本研究中，研究人员评估了一种新型基于片剂的H&E组织化学染色方法相较于传统液体试剂的诊断充分性和非劣效性。方法：从常规实践中选取50份福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本，每份样本切取双份切片，分别采用传统方法或H&E染色片剂进行染色。经切片复审后，选取14份代表性组织样本，在40×放大倍数下扫描，并生成24对匹配图像（不同放大倍数）。13名专家病理学家使用高质量显示器完成盲法在线调查。参与者评估整体染色偏好，并对间质、上皮、胞质和细胞核染色质量进行评分。采用预设界值?0.10检验非劣效性，并使用Wilcoxon符号秩检验分析配对评分差异。结果：在312对评估中，片剂法获偏好120例（38.5%），传统染色118例（37.8%），无偏好74例（23.7%）。片剂法满足与传统染色相比的非劣效性标准（z = 2.7）。评分量表分析显示，片剂法在间质评估方面显著更优（z = 2.638；p = 0.008），而上皮、胞质和细胞核染色无显著差异。所有评估图像均被认为诊断充分。结论：基于片剂的H&E染色非劣于传统方法，尤其在间质成分评估方面表现出色。这些结果支持其在改善染色可重复性和标准化方面的潜力，尤其在对分析前及分析一致性至关重要的数字病理学工作流程中。
**研究背景与现存问题**
苏木精和伊红（H&E）染色作为解剖病理学逾百年的基石，是应用最广泛的组织染色方法。恰当的染色可清晰呈现细胞和间质成分，辅助组织学检查，提升诊断信心与可重复性，并减少因形态学不确定而需额外切片或免疫组织化学的需求。然而，H&E染色在实验室内部及实验室间存在显著变异，原因包括：苏木精和伊红常以预稀释溶液形式供应，易受温度、储存时间等因素影响而降解，增加运输储存成本和环境负担；组织切片厚度影响染色质量；不同病理学家对苏木精–伊红平衡的主观偏好也导致差异。尽管美国病理学家学会（CAP）和英国国家外部质量评估服务（UK NEQAS）等机构努力提升染色质量，但普遍接受的客观评估标准仍缺失，病理学家多依赖经验与主观偏好判断染色充分性。这一问题在数字病理学中尤为关键，因为染色变异会同时影响全切片图像（WSI）判读和人工智能算法性能。已有研究探索WSI的数字归一化或虚拟H&E染色，但尚无研究从染色流程层面实现标准化。为此，研究人员评估了一种旨在提升染色可重复性的新型片剂型H&E组织化学染色方法。本研究论文发表在《Diagnostics》。
**主要关键技术方法**
研究采用非劣效性设计，样本队列来自50份连续福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本（来自常规临床实践），每份切取双份5 μm切片，分别以传统预稀释液体试剂和H&E染色片剂（Diapath S.p.A.）染色。经3名病理学家复审后，基于组织学和组织类型多样性选出14对切片，使用NanoZoomer 360SD扫描仪（Hamamatsu Photonics）在40×放大倍数下数字化，并生成24对图像（含5×、10×、20×、40×放大倍数）。14名专家病理学家（来自不同中心）使用高质量显示器（27至75英寸，最低分辨率3840×2160，8 MP）完成基于JotForm平台的盲法在线调查。调查包含整体染色偏好（对整体强度、特异性、均匀性、背景、颗粒及对比度评估）及上皮/炎症成分、间质、细胞核、胞质的1–3分评分量表。统计分析采用单侧z检验（非劣效界值?0.10）和Wilcoxon符号秩检验。
**研究结果**
- **整体偏好分析与非劣效性**：13名病理学家对24对图像共完成312对评估，无缺失数据。片剂法在120/312（38.5%）中获偏好，传统染色在118/312（37.8%）中获偏好，无偏好为74/312（23.7%）。片剂法满足非劣效性标准（z = 2.7）。相比之下，在次优环境条件下完成预测试的8名志愿者病理学家数据未能显示非劣效性（z = 1.43）。
- **分类评分量表结果**：
- **间质**：片剂法显著优于传统染色（z = 2.638；p = 0.008），具体表现为片剂法中高分（3分）比例更高（206/312，66.0% vs. 170/312，54.5%），低分（1分）比例更低（13/312，4.2% vs. 16/312，5.1%）。
- **上皮**：无显著差异（z = 0.334；p = 0.738），高质量染色比例相近（62.8% vs. 63.1%）。
- **胞质**：无显著差异（z = 1.107；p = 0.268），片剂法高分比例略高（61.2% vs. 57.4%）。
- **细胞核**：无显著差异（z = 1.340；p = 0.180），片剂法高分比例较高（59.9% vs. 56.4%），低分比例较低（7.1% vs. 10.6%）。
所有评估图像均被认为诊断充分。
**讨论与结论**
讨论部分指出，H&E染色质量主要依赖苏木精与伊红的平衡，而现有技术存在高变异性和缺乏标准化评估标准，这限制了数字病理学的发展。片剂型染色法通过将染料片剂溶于蒸馏水，避免了预稀释溶液降解风险，旨在提升实验室内部及间可重复性。本研究中，片剂法在所有图像中均提供足够诊断质量的图像，且非劣效于传统方法。间质评估的显著优势可能归因于片剂法产生的苏木精染色更浅，增强了间质成分的对比度，同时不影响细胞核评估，使核仁和核分裂象更易观察。该化学染色法不依赖虚拟染色方法的地面实况限制，且易于整合至常规数字病理学工作流程，仅需额外稀释片剂和过滤步骤，在储存运输及标准化方面具有优势。研究还强调，显示器质量和环境条件是WSI评估的重要分析前变量——仅在专家队列使用高质量显示器和优化环境时才能证明非劣效性。局限性包括样本类型不完全（缺乏肺、膀胱、淋巴结、骨、中枢神经系统组织）、单中心样本采集无法评估实验室间变异。未来需开展多中心评估，纳入不同实验室、染色平台和组织类型。
**研究结论**：鉴于缺乏广泛接受的H&E染色充分性评估标准，研究人员开发了一种用户友好的数字调查工具，用于评估片剂型H&E染色方法的非劣效性。结果显示该方法非劣于传统染色，且在间质成分评估中表现尤佳。鉴于解剖病理学对标准化的需求日益增长，应大力推动共享评估标准的制定与传播。H&E染色质量、显示器特性和环境条件应被视为数字病理学中重要的分析前和分析变量。对这些参数的精细控制可减少实验室内部及间变异，并进一步提升数字病理学工作流程和图像分析算法在常规临床实践中的有效性。在确立非劣效性后，需进一步研究评估片剂型H&E染色方法对染色变异性的影响（包括实验室内部和间可重复性），并辅以定量分析评估。
