桑树（Morus atropurpurea）MYB家族的全基因组鉴定及MaDIV在花青素生物合成中可能参与的功能表征

《Genes》：Genome-Wide Identification of the MYB Family in Morus atropurpurea and Functional Characterization of MaDIV for Its Possible Involvement in Anthocyanin Biosynthesis

　　

背景：花青素生物合成受到MYB转录因子（TFs）的严格调控，但抑制因子，特别是DIVARICATA-like（DIV）亚家族中的抑制因子，其作用仍未被充分表征。方法：利用隐马尔可夫模型（HMM）和基于BLAST的搜索，在桑树（Morus atropurpurea）基因组中进行了MYB家族成员的全基因组鉴定。对推定的MYB基因进行了系统发育分类，并分析了它们在三个果实发育阶段的表达谱。一个DIV-like R2R3-MYB候选基因MaDIV，通过亚细胞定位、实时定量PCR（qRT-PCR）和在烟草中的异源过表达对其进行了功能表征。结果：共鉴定出145个MaMYB基因，并将其分为31个不同的亚家族。MaDIV表达在果实成熟过程中逐渐下降，这与花青素积累的增加显著相关。在烟草中异源过表达MaDIV导致花中花青素含量与野生型植物相比减少42%。同时，关键的花青素生物合成基因NtDFR的表达受到强烈抑制，而黄酮醇合酶基因NtFLS1则显著上调。结论：这些发现表明MaDIV可能参与花青素生物合成的调控，并为植物中DIV-like MYB亚家族的功能多样化提供了初步证据。该结果有助于更好地理解桑树及近缘物种果实着色的转录调控。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
花青素是类黄酮的主要类别，赋予植物组织红、紫、蓝色调，在传粉吸引和种子传播中发挥关键生态作用，并因强抗氧化活性及与慢性疾病风险降低的关联而具有健康价值。其生物合成通过苯丙烷途径的类黄酮分支进行，主要受转录水平调控。核心调控模块涉及MYB-bHLH-WD40（MBW）蛋白复合物，其中MYB转录因子作为激活子或抑制子精细调控花青素产生。在桑树中，已有多个花青素激活子MYB被报道，但对抑制性成员，特别是DIVARICATA-like（DIV）亚家族的系统性鉴定和功能表征仍有限。DIV-like MYB主要已知参与发育过程，其在果实作物中抑制花青素的角色尚未确立。桑树是重要的经济物种，其果实富含花青素，但调控色素积累的机制，尤其是转录抑制子介导的机制，尚未被充分阐明。本研究旨在系统鉴定桑树MYB家族成员，筛选与花青素积累负相关的候选基因，并功能表征一个DIV-like MYB在花青素调控中的作用。

**研究内容与结论**
研究人员对桑树（Morus atropurpurea）ZS5801品种进行了MYB家族的全基因组鉴定，共鉴定出145个MaMYB基因，系统发育分析将其分为31个亚家族。其中，MaDIV（一个DIV-like R2R3-MYB）的表达在果实成熟过程中逐渐下降，与花青素积累增加显著负相关。通过亚细胞定位确认MaDIV定位于细胞核；在烟草中异源过表达MaDIV导致花中花青素含量较野生型降低42%，同时关键花青素合成基因NtDFR被强烈抑制，而黄酮醇合酶基因NtFLS1上调。这些结果提示MaDIV可能参与花青素生物合成的调控，并为DIV-like MYB亚家族的功能多样化提供了初步证据。该论文发表在《Genes》期刊上。

**主要技术方法**（不超过250字）
1. **全基因组MYB鉴定**：利用隐马尔可夫模型（HMM）和BLASTP搜索对桑树ZS5801基因组（重庆蚕业科学技术研究院及西南大学资源昆虫国家重点实验室提供）进行MYB成员筛选。
2. **系统发育与表达分析**：使用IQ-TREE 2构建系统发育树，结合拟南芥分类；基于转录组数据（三个果实发育阶段：S1绿色、S2转色、S3成熟）分析MaMYB基因表达谱。
3. **基因功能表征**：通过亚细胞定位（MaDIV-GFP融合蛋白在烟草叶瞬时表达）、实时定量PCR（qRT-PCR，内参基因MaRPL15和NtActin）检测表达；在烟草中异源过表达MaDIV（使用pLGNL载体），分析花青素含量及花青素生物合成基因表达变化。

**研究结果**
**3.1 桑树MYB家族基因鉴定**
通过全基因组分析共鉴定145个MaMYB基因，不均匀分布在全部14条染色体上，8号染色体最多（20个），1、2、13号染色体最少（各5个）。蛋白长度、分子量和等电点多样，多数预测定位于细胞核。

**3.2 MaMYB蛋白的系统发育与基因重复分析**
与拟南芥MYB蛋白比对，145个MaMYB归入31个亚家族；C4亚家族在桑树中显著扩张（20个基因 vs. 拟南芥9个），S5亚家族亦然（9 vs. 1）。检测到19对串联重复基因对，Ka/Ks分析表明受强烈纯化选择；无近期全基因组重复事件，分散重复基因对也主要受纯化选择约束。

**3.3 保守基序与基因结构分析**
同一亚家族蛋白共享相似基序组成和内含子-外显子结构。共鉴定8个基序（motif 1–8），主要位于N端。启动子顺式元件分析显示光响应元件最多（1300个，17.37%），其次为激素响应元件（脱落酸、乙烯、茉莉酸、赤霉素）、胁迫响应元件及MYB（835个，11.16%）、MYC（446个，5.96%）结合位点。基因外显子数1–16个不等，同一亚家族内结构保守。

**3.4 MaDIV与桑树花青素负相关**
基于转录组FPKM值（三个发育阶段），筛选出在两个候选基因（07545.1和MaDIV/20078.1）中，表达随果实成熟持续下降。MaDIV属于DIVARICATA-like亚家族，其表达在S2和S3阶段较S1分别下降15.28%和49.17%，与花青素含量增加（S2↑750.7%，S3↑3414.5%）显著负相关。亚细胞定位证实MaDIV定位于细胞核；序列比对显示其具有保守的R2和R3结构域及特征性色氨酸残基间隔模式。

**3.5 烟草中过表达MaDIV与花青素生物合成相关**
成功获得稳定过表达MaDIV的转基因烟草株系，转基因花中花青素含量较野生型降低42%（0.249 A₅₃₀/g FW vs. 对照）。核心花青素合成基因NtPAL、NtC4H、Nt4CL、NtCHS、NtCHI、NtF3H和NtDFR显著下调，而NtFLS1显著上调，NtFLS2无显著变化。桑果中MaFLS表达随果实成熟下调，与MaDIV表达模式平行，与花青素积累反向相关。

**讨论总结与结论翻译**
**讨论总结**：本研究提示MaDIV可能参与花青素生物合成调控，但需直接证据（如启动子结合实验）确认。全基因组分析鉴定了145个MaMYB，较已报道的103个（M. alba）有所扩展，反映谱系特异性适应。DIV-like亚家族保守的基序和基因结构暗示功能保守。MaDIV作为单拷贝基因，其表达下降模式与已报道抑制子一致。异源过表达使花青素降低并抑制DFR、上调FLS1，暗示代谢流可能从花青素转向黄酮醇，但缺乏代谢物数据支持。由于异源体系局限性及缺乏桑树自身功能缺失研究，MaDIV目前被视为候选调控因子。未来需通过酵母单杂交、双荧光素酶报告系统、EMSA或ChIP-qPCR验证直接结合靶基因启动子，并辅以代谢组学分析。

**结论翻译（5. Conclusions）**：总之，全基因组分析鉴定了145个MaMYB基因，归入31个亚家族，MaDIV的功能表征表明其可能参与桑树花青素积累。此项工作为进一步研究果实作物中DIV-like MYB转录因子奠定了基础。