《Animals》：Extracellular Vesicles from Canine Mesenchymal Stem Cells—Isolation, Characterization and miRNA Definition Following Interleukin-1? and Shockwave Treatment
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细胞外囊泡（EVs）已成为研究的关键领域，因为科研人员研究它们在各种生物过程中的作用。这些囊泡似乎在利用间充质信号细胞（MSCs，以前称为间充质干细胞）治疗多种疾病（如骨关节炎（OA）和其他退行性疾病）中发挥关键作用。在研究中，研究人员检查了犬间充质信号细胞（
细胞外囊泡（EVs）已成为研究的关键领域，因为科研人员研究它们在各种生物过程中的作用。这些囊泡似乎在利用间充质信号细胞（MSCs，以前称为间充质干细胞）治疗多种疾病（如骨关节炎（OA）和其他退行性疾病）中发挥关键作用。在研究中，研究人员检查了犬间充质信号细胞（MSCs）形成的EVs，以根据现行指南对其进行鉴定，并确定其内容物，特别是所含的微小RNA（miRNA），用于未来研究项目。获取EVs后，通过蛋白质印迹和透射电子显微镜证明，纳米追踪分析中可见的纳米颗粒分别对CD9和ALIX阳性，以及对CD9和CD81阳性。对于不代表细胞外颗粒的纳米颗粒标志物——本研究以线粒体颗粒的细胞色素C和核颗粒的组蛋白进行测试——结果为阴性。最后，在阴性对照中检测到总共85种不同的miRNA。为确定旨在诱导骨关节炎（例如白细胞介素-1β刺激）或可能治疗（例如冲击波疗法）的各种细胞刺激的潜在影响，或在提取细胞外囊泡之前ITS的影响，研究人员检测到总共208种不同的miRNA。这些结果表明，如何体外检测犬MSC来源的EVs，以及刺激产生细胞后EVs的miRNA谱如何变化。这些信息可能为理解骨关节炎及其治疗提供有价值的见解。此外，研究人员证明，由于miRNA表达水平的显著变化，应考虑使用ITS替代FCS来产生EVs。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
细胞外囊泡（EVs）是介导细胞间通讯的纳米级膜结合颗粒，在再生医学中日益重要。间充质干细胞（MSCs）已知对骨关节炎（OA）等退行性疾病具有治疗潜力，但其主要作用并非分化为目标组织细胞，而是通过旁分泌信号发挥调节功能。近年研究聚焦于MSC分泌的EVs作为关键信使，使用MSC来源的EVs可避免自体MSC培养缓慢、质量不一致及活细胞移植的副作用等缺点。然而，犬MSC来源EVs的分离、鉴定及其内容物（尤其微小RNA（miRNA））尚缺乏系统研究。此外，OA在犬和人类中发病率高且仅能对症治疗，需要开发基于EVs的细胞-free疗法。本研究旨在从犬MSCs中分离EVs，明确其身份并排除细胞碎片污染，分析不同刺激（模拟OA炎症的IL-1β、治疗性冲击波、无血清培养基ITS补充）对EVs miRNA谱的影响，为后续OA研究和治疗提供基础。论文发表在《Animals》。
**关键技术与方法**
样本来源：犬脂肪组织（来自进行非炎症非感染手术的犬只）。主要方法：①脂肪间充质干细胞（AdMSCs）分离与鉴定：胶原酶消化、贴壁培养，通过三系分化（成脂、成骨、成软骨）及流式细胞术（阳性标志物CD44、CD90；阴性标志物CD45、MHC II）验证干细胞特性。②EVs收集与浓缩：超速离心（100,000×g）或超滤（100 kDa滤器）浓缩细胞培养上清。③纳米颗粒追踪分析（NTA）：测量粒径和浓度。④透射电子显微镜（TEM）免疫金标记：检测表面分子CD9和CD81。⑤蛋白质印迹（Western blot）：检测EV标志物（CD9、ALIX、CD81）和排除标志物（组蛋白、细胞色素C）。⑥下一代测序（NGS）：构建小RNA文库，Illumina测序，生物信息学分析（Bowtie2比对、HTSeq定量、DESeq2差异表达分析）。
**研究结果**
**3.1 犬脂肪MSCs的培养与表征**：从脂肪组织分离的AdMSCs呈典型梭形贴壁生长；经成脂、成骨、成软骨诱导后，分别通过油红O、茜素红、阿利新蓝染色证实分化成功；流式细胞术检测到CD44和CD90阳性，CD45和MHC II阴性，符合国际细胞治疗学会（ISCT）标准。
**3.2 EVs收集与浓缩**：NTA分析显示，超速离心后颗粒平均粒径（168.7±13 nm）显著大于超滤（145±13.97 nm，p=0.040），可能因超速离心导致轻微聚集；浓度方面超速离心（6.29±6.47×10? particles/mL）虽约为超滤（3.68±2.29×10? particles/mL）的两倍，但未达统计学显著（p=0.054）。
**3.3 EVs分析**：Western blot检测到EV标志物CD9和ALIX阳性，而核颗粒标志物组蛋白和线粒体标志物细胞色素C在纯化样品中均阴性，仅在细胞裂解液中阳性；TEM免疫金标记证实CD9和CD81可特异性标记EVs。
**3.4 NGS分析**：共检测到209种犬miRNA。阴性对照（Exo-FCS处理）中84种，冲击波处理后69种，IL-1β处理后90种，ITS培养后201种。差异表达分析显示：与阴性对照相比，冲击波处理导致3个miRNA显著变化（2个上调，1个下调），IL-1β处理导致9个显著变化（8个上调，1个下调），ITS培养导致83个显著变化（全部上调）。PCA和相关性热图表明，ITS样品形成最明显独立簇，冲击波样品次之，阴性对照和IL-1β样品聚类不清晰，提示处理条件主导转录组变化，而供体间差异影响较小。
**讨论与结论**
本研究成功从犬MSCs中纯化EVs，使用适宜抗体（CD9、CD81、ALIX）明确确认其身份，并通过排除组蛋白和细胞色素C证明无细胞组分污染。不同刺激条件下miRNA谱显著改变，尤其ITS补充导致大量miRNA上调，表明培养基条件对EV内容物有重要影响，建议未来研究严格标准化EV收集方法。尽管IL-1β和冲击波处理仅改变少量miRNA（如共同下调miR-199），但文献提示miR-199参与软骨生成分化；miR-24和miR-361的变化可能涉及应激反应和上皮间质转化。因样本量较小，通过PCA和相关性分析确认处理效应主导；需要后续功能验证（如靶细胞实验）以明确这些miRNA在OA炎症和再生中的作用。研究结论原文翻译：“我们成功利用所述方法从犬MSCs中纯化EVs。我们使用合适的抗体明确确认了EVs的身份，同时排除了可能被误认为是EVs的颗粒污染物。NGS揭示，不同刺激条件显著改变了多个miRNA的表达。特别是无FCS培养（添加ITS）观察到的显著效应，为培养条件如何影响与EVs相关的miRNA谱提供了重要见解。这些效应也强调了在细胞外囊泡研究中严格标准化的必要性。由于供体数量有限，我们还通过相关性热图和主成分分析（PCA）评估了全局样本结构，以区分处理效应和供体相关变异。这些分析显示，ITS处理样品形成最清晰且最独特的簇，其次是冲击波处理样品。而阴性对照和IL-1β组聚类不清晰且重叠较多。尽管如此，这些结果表明观察到的转录组变化主要归因于实验条件，而供体相关变异作用较小。所获得的miRNA数据为后续在MSCs或软骨细胞测定中对单个候选miRNA进行靶向功能验证，以研究其在炎症和再生过程中的作用提供了基础。因此，这些发现可能有助于兽医学，并可作为人类再生研究的转化模型。”
