长期保护管理濒危的加那利蜥蜴 *Gallotia simonyi* 和 *G. bravoana*（蜥蜴科）（2006–2024）

《Animals》：Long-Term Conservation Management of the Endangered Canarian Lizards Gallotia simonyi and G. bravoana (Fam. Lacertidae) (2006–2024)

　　

膳食惰性消化率标记物对肠道微生物群和肠道发酵的影响仍知之甚少。本研究利用离体（*ex vivo*）和体内（*in vivo*）相结合的方法，调查了在饲料中添加4 kg/吨二氧化钛（titanium dioxide，TiO₂）（代表动物营养研究中使用的典型剂量）对肉鸡发酵动态和微生物组成的影响。离体实验采用从32日龄肉鸡收集的回肠和盲肠微生物群及底物进行发酵。二氧化钛（TiO₂）直接添加到发酵体系中，以产气量和短链脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）谱作为主要结局指标。同时，392只肉鸡被喂食含或不含TiO₂的饲料32天，采用乌枪法宏基因组测序（shotgun metagenomic sequencing）分析回肠和盲肠食糜的发酵终产物和微生物组成。研究人员还进行了第二次离体实验，使用适应了膳食TiO₂的微生物群。在第一个离体模型中，TiO₂降低了回肠的产气量和乙酸浓度（*p* < 0.05），而在盲肠中，TiO₂增加了产气量、总真细菌计数和支链脂肪酸（branched-chain fatty acid，BCFA）（*p* < 0.05）。在体内，TiO₂不影响生长性能或器官发育，但显著增加了盲肠中异丁酸和总BCFA浓度（*p* < 0.05）。宏基因组分析显示，盲肠α多样性（香农指数）增加，与氨基酸代谢相关的分类群富集，包括 *Massilicoli timonensis*、*Blautia merdavium*、*Rubneribacter badeniensis* 和 *Mediterraneibacter caccavium*。第二次离体实验显示出相似的趋势，产气量和BCFA产量增加。总体而言，这些结果表明TiO₂可以以肠段特异性方式调节肠道发酵和微生物组成，提示膳食标记物可能并非生物学惰性。

**论文解读：二氧化钛对肉鸡肠道微生物发酵与组成的肠段特异性影响**

**研究背景与问题**
在动物营养研究中，惰性消化率标记物（如二氧化钛，TiO₂）被广泛用于评估营养物沿胃肠道的利用率和消化率，以替代耗时耗力的全收粪法。然而，最近的研究对标记物的生物学惰性提出了质疑，发现其回收率存在变异、可能与消化酶相互作用、改变肠道屏障功能，并可能影响肠道微生物群及其代谢通路。特别是，TiO₂纳米颗粒已被报道可扰乱肠道微生物群组成（如减少 *Prevotella* 和 *Bacteroides* 等有益菌属）、增加肠道通透性、诱发免疫激活及氧化应激。但这些研究多集中于哺乳动物，对家禽（尤其是肉鸡）肠道微生物发酵和短链脂肪酸（SCFA）的影响尚缺乏系统评估。此外，由于体内研究受微生物个体差异和代谢物快速吸收的限制，难以准确监测发酵动力学。因此，研究人员结合离体和体内方法，探究典型剂量的TiO₂对肉鸡回肠和盲肠发酵活动及微生物群的影响，以评估其作为标记物的潜在生物学效应。该论文发表在《Animals》期刊。

**主要关键技术方法**
1. **离体发酵模型**：采用从32日龄Ross 308肉鸡收集的回肠内容物（制备回肠模型底物）及回肠/盲肠混合内容物（制备盲肠模型底物），澄清后用作细菌生长底物。接种物来自35日龄喂食相同无添加剂饲料的肉鸡新鲜回肠或盲肠食糜，在厌氧条件下模拟肠道环境，控制温度（42℃）和混匀速度（100 rpm）。产气量通过高精度玻璃注射器手动测量，发酵终产物（挥发性脂肪酸和乳酸）采用气相色谱法（gas chromatography，GC）定量，总真细菌计数通过定量实时PCR（qPCR）测定16S rRNA基因。
2. **体内饲养试验**：共有392只1日龄雄性Ross 308肉鸡，随机分为对照组（无TiO₂）和TiO₂组（添加4 g/kg TiO₂），每组196只（14个重复圈，每圈14只鸡）。试验期32天，记录饲料采食量、体重、死亡率，计算饲料转化率（FCR），并在第14、21、32天采集内脏器官称重。第32天从每组随机选取24只鸡，收集回肠和盲肠食糜用于挥发性脂肪酸（VFA）和乳酸分析，以及乌枪法宏基因组测序（shotgun metagenomic sequencing）。测序使用AVITI^TM平台（2×150 bp双端），平均深度2000万读段/样本。数据分析使用CosmosID-HUB云平台进行质控、宿主序列去除、分类学注释（基于k-mer的柯伊伯分类器和GenBook^TM数据库），以及α多样性（香农指数、Chao1指数、辛普森指数）、β多样性（基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）和PERMANOVA），差异丰富分类群通过线性判别分析效应大小（LEfSe）鉴定（Kruskal-Wallis *p* < 0.038，LDA score > 3.23）。
3. **第二次离体实验**：评价微生物群适应TiO₂后对盲肠发酵的影响。从体内试验第32天（每组20只）和第35天（每组10只）的TiO₂组和对照组鸡只中收集底物和接种物，各自用于建立发酵体系（每组10个独立发酵瓶），其余操作与第一次离体实验相同。

**研究结果**

**3.1 离体实验I中的微生物与发酵反应**
- **回肠离体模型**：与对照组相比，TiO₂处理组在0-5 h、5-8 h及0-8 h累积产气量均显著降低（*p* < 0.05），表明TiO₂抑制了回肠发酵活性。发酵8 h后，总真细菌计数无差异，但乙酸浓度显著降低（*p* < 0.05），乳酸浓度不受影响。
- **盲肠离体模型**：TiO₂处理组在0-5 h产气量及0-9 h累积产气量显著高于对照组（*p* < 0.05），5-9 h无差异。发酵9 h后，总真细菌计数显著增高（*p* < 0.05）。SCFA谱中，丙酸浓度显著升高（*p* < 0.05），戊酸、丁酸、总VFA和总SCFA的数值升高但无统计差异；同时，总支链脂肪酸（BCFA）以及异丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸浓度均显著升高（*p* < 0.05）。

**3.2 体内生长性能与生理应答**
- **生长性能**：TiO₂组与对照组在采食量、体增重、死亡率校正FCR（mFCR）及体重方面无显著差异。但TiO₂组在0-14 d（*p* = 0.061）和21-32 d（*p* = 0.099）的mFCR数值上略高（趋近显著），21-32 d体增重有降低趋势（*p* = 0.060）。总体表现TiO₂不影响生产性能。
- **内脏器官**：各日龄的嗉囊、肌胃、肝脏绝对和相对重量，以及空肠相对长度无显著差异。第32天TiO₂组回肠相对长度有增高趋势（*p* = 0.051）。
- **回肠和盲肠食糜VFA与乳酸浓度**：回肠和盲肠的总SCFA、乳酸浓度无差异。盲肠中丙酸、丁酸、总VFA、总SCFA无影响，但异丁酸和总BCFA浓度在TiO₂组显著高于对照组（*p* < 0.05）。戊酸、2-甲基丁酸、异戊酸、乳酸无显著差异。
- **序列分析**：回肠样本中α多样性（香农指数）无差异。盲肠样本中，TiO₂组的香农指数显著高于对照组（*p* = 0.021），Chao1指数数值增加（趋近显著，*p* = 0.057），辛普森指数无差异。β多样性（Bray-Curtis距离的PCoA）分析显示回肠和盲肠的群落组成在两组间无显著差异（PERMANOVA）。LEfSe分析确定了5个在TiO₂组盲肠中显著富集的菌种：*Thomasclavelia merdavium*（中位丰度2.0% vs 0.5%）、*Massilicoli timonensis*（1.0%）、*Blautia merdavium*（0.75%）、*Rubneribacter badeniensis*（1.0%）、*Mediterraneibacter caccavium*（0.5%）。在属水平上，*Thomasclavelia* 在TiO₂组平均相对丰度为3.2%，对照组为0.9%。

**3.3 离体实验II：盲肠模型的发酵反应**
- **产气量**：第二次离体实验中，所有时间段的产气量及累积产气量在TiO₂组与对照组间均无显著差异。
- **发酵终产物浓度**：TiO₂组的丙酸浓度显著高于对照组（*p* < 0.05）。总BCFA和单个BCFA（异丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸）的变化趋势与离体实验I一致（数值增加），但未达到统计显著。

**讨论与结论总结**
讨论部分指出，离体实验与体内实验结果共同表明TiO₂以肠段特异性方式调控微生物发酵：在回肠降低产气量和乙酸盐（反映碳水化合物发酵减弱），在盲肠增加产气量和BCFA（反映蛋白降解增强），这与盲肠微生物群更高的多样性和蛋白利用能力一致。TiO₂不影响生长性能，但盲肠中BCFA的增加及特定菌种（与氨基酸代谢相关）的富集进一步支持其对氮流或微生物代谢偏好的调节作用。第二次离体实验（采用适应TiO₂的微生物群）虽未达显著，但趋势与首次离体及体内观察一致，提示微生物适应可能影响应答幅度。

**研究结论**：离体模型为研究肠道微生物群（包括未培养群体）在其自然生态背景下的功能提供了生理相关平台。采用经膳食干预适应后的微生物接种物可提高离体模型的解读能力，因其反映了已发生的体内适应。本研究中，离体与体内方法的结合获得了一致结果，表明TiO₂无论暴露方式如何，均适度影响微生物发酵活性。这些发现强调了微生物适应性和膳食背景在解释离体数据中的重要性，并支持将其与体内模型整合以更好评估肠道微生物功能和营养策略。