《BioChip Journal》：Dual-Targeted Photothermal Therapy of Melanoma and Pro-metastatic Exosomes Using Lectin-Functionalized Gold Nanorods
编辑推荐：
黑素瘤是一种高度转移性的恶性肿瘤，其中肿瘤来源的外泌体（exosomes）在转移前微环境形成和转移进展中发挥关键作用。然而，大多数传统治疗策略主要针对原发肿瘤细胞，而忽视了促进转移的外泌体。在本研究中，研究人员开发了一种由黑接骨木凝集素（Sambucus ni
黑素瘤是一种高度转移性的恶性肿瘤，其中肿瘤来源的外泌体（exosomes）在转移前微环境形成和转移进展中发挥关键作用。然而，大多数传统治疗策略主要针对原发肿瘤细胞，而忽视了促进转移的外泌体。在本研究中，研究人员开发了一种由黑接骨木凝集素（Sambucus nigra agglutinin, SNA）功能化金纳米棒（SNA-functionalized gold nanorods, SNA-AuNRs）组成的双重靶向光热纳米平台，能够通过α-2,6唾液酸（α-2,6 sialic acid）靶向同时识别黑素瘤细胞和黑素瘤来源的外泌体。SNA-AuNRs通过聚乙二醇化（PEGylation）和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）偶联化学将SNA凝集素偶联到金纳米棒上，随后进行理化性质和生物学特性表征。合成的SNA-AuNRs保留了强近红外（near-infrared, NIR）吸收特性，并表现出高效的光热转换效率，在850 nm NIR照射10 min后温度可达到约53 ℃。体外研究表明，与正常细胞对照相比，SNA-AuNRs对黑素瘤细胞和黑素瘤来源的外泌体具有增强的结合亲和力。值得注意的是，SNA-AuNRs对黑素瘤来源外泌体的结合效率约为51.3%，与正常细胞来源的外泌体相比增加了约5.8倍。在NIR照射下，SNA-AuNRs诱导黑素瘤细胞产生显著的光热细胞毒性，同时在正常细胞中保持较高的暗态生物相容性。此外，Transwell迁移实验表明SNA-AuNRs能够有效捕获并锚定黑素瘤来源的外泌体，提示形成持续的局部化学吸引物梯度与增强的细胞迁移相关。这些发现表明，SNA-AuNRs提供了一种有前景的双重靶向光热策略，能够同时靶向黑素瘤细胞和与转移相关的外泌体，用于潜在的抗转移治疗。
癌症仍是全球主要的死亡原因之一，其显著的异质性和转移倾向给治疗带来了重大挑战。黑素瘤起源于神经嵴来源的黑素细胞，具有高度的细胞迁移能力，在肿瘤发生过程中表现出侵袭性强的行为。对于转移性黑素瘤患者，手术切除很少能治愈，常规化疗和靶向治疗常因耐药性快速出现和继发性突变而失败。一旦发生远处内脏器官播散，疾病将极难控制。在高运动性、快速增殖和强免疫逃逸机制的驱动下，转移性黑素瘤对标准治疗表现出显著抵抗，五年生存率不足30%。
近期研究揭示了肿瘤来源外泌体在远处组织建立转移前微环境中的关键作用，阐明了黑素瘤侵袭性扩散的生物学机制。外泌体是从其亲代细胞继承分子特征的双层膜囊泡，作为纳米级囊泡转运多种微小RNA（miRNA）、蛋白和免疫调节因子以促进细胞间通讯。黑素瘤进展高度依赖这种外泌体介导的信号网络，这些细胞外囊泡通过促进上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）、刺激血管生成和淋巴管生成、以及为远处定植准备微环境等方式主动驱动转移。值得注意的是，特定的外泌体表面分子和货物（包括特定的整合素谱、MET和酪氨酸酶相关蛋白2）决定了靶器官趋向性和整体恶性程度。因此，专门设计用于拦截和中和黑素瘤来源外泌体的治疗策略，为阻止转移播散提供了极具前景的途径。
恶性转化的一个标志是异常细胞糖基化，常表现为肿瘤细胞表面末端唾液酸残基的过表达，这一特征在黑素瘤中尤为突出。特别是α-2,6唾液酸化与增强的黑素瘤侵袭性、转移潜能和免疫逃逸相关，使其成为转移性黑素瘤治疗中生物学相关的靶点。由于外泌体继承了其来源细胞的脂质和膜蛋白组成，黑素瘤来源外泌体同时呈现高水平唾液酸。为利用这一共享分子特征，研究人员选用了SNA，一种已知对α-2,6唾液酸具有高度特异性的凝集素。
尽管外泌体在驱动癌症进展中的作用已得到充分确立，传统治疗策略仍主要集中于根除原发肿瘤细胞，对系统性促转移介质缺乏有效控制。纳米医学通过实现精准定位和整合多种治疗方式，为弥补这一差距提供了有力策略。对于像黑素瘤这样的高度转移性恶性肿瘤，开发能够同时作用于原发肿瘤细胞和循环外泌体的平台对于有效抗转移反应至关重要。
金纳米棒（gold nanorods, AuNRs）以其强的近红外吸收和高的光热转换效率而著称，已被广泛用作癌症治疗中的有效光热剂。在前期研究中，研究人员已证明SNA偶联的中空金-氧化铁纳米粒子通过糖靶向和光热免疫治疗增强了巨噬细胞介导的吞噬作用。在此基础上，本研究进一步扩展该糖靶向策略的治疗范围，同时靶向黑素瘤细胞与和转移进展相关的黑素瘤来源外泌体。
**SNA-AuNRs的合成与表征**
研究人员采用种子介导生长法合成金纳米棒，并通过聚乙二醇化和EDC/NHS偶联化学将SNA凝集素共价固定于金纳米棒表面。动态光散射（dynamic light scattering, DLS）和场发射透射电子显微镜（field-emission transmission electron microscopy, FE-TEM）证实了棒状纳米粒子的成功形成。DLS分析显示两个主要粒径分布：横向17.66 nm和纵向125.6 nm，与FE-TEM图像中观察到的各向异性形貌一致。原始金纳米棒因十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide, CTAB）稳定化而呈强正电性，经SH-PEG-COOH功能化后表面电荷因暴露羧基而转为负电；SNA偶联后又因引入蛋白质胺基而略微正移。紫外-可见-近红外光谱显示，SNA偶联后金纳米棒的局域表面等离子体共振（localized surface plasmon resonance, LSPR）峰位未发生明显偏移，表明结构完整性得以保持。光热转换实验表明，SNA-AuNR悬浮液（10 μg/mL，以SNA浓度计）在850 nm NIR照射10 min后温度迅速升至53 ℃，相比对照培养介质仅达41 ℃，具有显著的粒子驱动温升。
**细胞活力测试与SNA-AuNRs的抗癌效果**
通过细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8, CCK-8）实验评估SNA-AuNRs的固有细胞相容性（暗毒性）。将小鼠正常皮肤成纤维细胞L929和小鼠黑素瘤细胞系B16F1、B16F10与不同浓度SNA-AuNRs（高浓度10 μg/mL、中浓度5 μg/mL、低浓度2.5 μg/mL，均以SNA浓度计）孵育24 h，所有测试浓度和细胞系的细胞活力均保持在80%以上。活/死染色实验进一步证实，暗条件下SNA-AuNRs具有优异的生物相容性和可忽略的毒性。
光热治疗实验中，细胞经SNA-AuNRs处理24 h并彻底洗涤后，接受850 nm NIR激光照射最长10 min。CCK-8存活率实验显示，照射后正常细胞与肿瘤细胞存活率存在显著差异：照射10 min后，小鼠正常皮肤细胞的存活率比靶向的小鼠黑素瘤细胞高约约30%。活/死荧光染色显示，经SNA-AuNRs处理并照射10 min的黑素瘤细胞出现广泛的凋亡和坏死，呈现广泛的红色荧光。这些结果证明SNA-AuNRs选择性富集于黑素瘤细胞，经NIR激活后作为高效光热剂 maximize肿瘤根除同时最小化对健康组织的 collateral damage。
**SNA-AuNRs对细胞和外泌体的结合能力**
通过异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）偶联的SNA-AuNRs评估细胞靶向能力。共聚焦荧光显微镜显示，FITC-SNA-AuNRs对B16F10黑素瘤细胞的结合亲和力显著高于正常L929成纤维细胞，确认了癌细胞上α-2,6唾液酸的过表达及SNA功能化纳米棒的精准细胞靶向能力。
通过纳米粒子跟踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）定量评估纳米粒子对外泌体的靶向效率。SNA-AuNRs（10 μg/mL，以SNA浓度计）与等量（2×10
8 particles）B16F10或L929来源外泌体共孵育，结果显示SNA-AuNRs成功捕获约51.3%的B16F10来源外泌体，而仅结合8.8%的L929来源外泌体，对肿瘤来源囊泡的结合效率增加约5.8倍。这些发现明确证明SNA-AuNRs能够准确识别并结合黑素瘤细胞及其对应外泌体上过表达的α-2,6唾液酸，确立了同时作用于原发肿瘤细胞和介导转移的细胞外囊泡的双重靶向系统。
**外泌体诱导的细胞迁移及SNA-AuNRs的锚定作用**
为阐明肿瘤来源外泌体在驱动转移播散中的作用，研究人员通过Transwell迁移实验评估黑素瘤来源外泌体的化学吸引潜力。B16F10黑素瘤细胞接种于上室无血清培养基中，下室分别设置为B16F10来源外泌体单独组、预孵育的SNA-AuNR-外泌体复合物组、以及SNA-AuNRs单独组。孵育24 h后，结晶紫染色显示SNA-AuNR-外泌体复合物组诱导了最高程度的细胞迁移。SNA-AuNRs通过有效锚定结合的外泌体于下室，阻止囊泡的快速扩散或清除，从而建立了高度 robust且持续的化学吸引物梯度，持续吸引上室细胞。这些发现直接证实了肿瘤来源外泌体在诱导细胞趋化和建立转移前微环境中的关键作用，同时验证了SNA-AuNRs作为高效靶向平台，能够物理捕获并空间限制这些高度活跃的转移介质。在治疗背景下，有效定位这些促转移外泌体为后续通过NIR触发光热治疗在其促进系统性播散前予以清除奠定了基础。
**讨论与结论**
本研究开发了一种基于SNA功能化金纳米棒的双重靶向光热纳米平台，能够通过α-2,6唾液酸靶向同时识别黑素瘤细胞和黑素瘤来源外泌体。与传统光热治疗策略主要集中于直接肿瘤消融不同，肿瘤来源外泌体日益被认为是转移进展和转移前微环境形成的重要介质，因此同时靶向肿瘤细胞和肿瘤相关外泌体可能为转移性黑素瘤提供更广泛的治疗潜力。
前期糖靶向纳米粒子研究已证明了利用凝集素进行选择性癌症靶向的可行性。前期研究中SNA偶联纳米粒子通过糖识别增强了光热免疫治疗。本研究进一步将此策略扩展至黑素瘤来源外泌体，这些外泌体继承了亲代细胞的糖基化特征。SNA-AuNRs对黑素瘤来源外泌体相较于正常细胞来源外泌体增强的结合亲和力，支持了将α-2,6唾液酸作为黑素瘤细胞和外泌体共享靶点的可行性。
重要的是，Transwell迁移实验表明SNA-AuNR-外泌体复合物诱导了最高程度的细胞迁移，提示SNA-AuNRs有效锚定黑素瘤来源外泌体并维持了局部化学吸引物梯度。肿瘤来源外泌体已知可促进癌细胞移动性和转移微环境形成。在此语境下，SNA-AuNRs物理捕获并空间限制这些囊泡的能力，可能提供超越直接光热肿瘤消融的额外治疗优势。外泌体的局部化锚定可能通过空间限制外泌体相关转移介质在系统性播散前的分布，潜在改善后续NIR触发光热破坏的效果。
研究亦存在若干局限性：目前仅限于体外实验，SNA-AuNR平台的体内生物分布、转移抑制效力和生物安全性尚需研究；虽证实了与黑素瘤来源外泌体增强的结合，但未进行外泌体蛋白标志物和糖基表达谱的 detailed characterization，α-2,6唾液酸表达水平也未定量分析。因此，进一步的体内研究和糖组学表征对于验证该双重靶向策略的转化潜力是必需的。
总之，研究人员成功设计了SNA-AuNR双重靶向光热纳米平台，选择性识别原发黑素瘤细胞及其分泌外泌体上共表达的α-2,6唾液酸糖标记。功能化纳米棒对黑素瘤来源外泌体表现出51.3%的显著结合效率，与正常细胞对照相比捕获亲和力增加约5.8倍。研究表明SNA-AuNRs能够同时识别恶性细胞及其转移介导囊泡的双重靶向系统。NIR激发后，SNA-AuNRs表现出强光学热活性，诱导黑素瘤细胞选择性显著细胞毒性，同时对正常组织显示出优异的暗态生物相容性。体外Transwell迁移实验进一步确认：肿瘤来源外泌体是驱动癌细胞运动性的关键因素，同时SNA-AuNRs能够有效捕获并物理锚定这些促转移因子。通过同时靶向原发恶性细胞进行光热消融、以及定位与转移前微环境形成相关的外泌体介质，SNA-AuNR平台为转移性黑素瘤治疗提供了有前景的纳米医学策略。虽然进一步的体内研究对于验证其治疗潜力是必需的，但这一双重靶向方法为未来的抗转移纳米医学策略奠定了基础。
