源自ELN的Tetrastigma hemsleyanum miR-396b通过靶向IL33抑制胰腺癌细胞增殖

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Tetrastigma hemsleyanum ELN-Derived miR-396b Suppresses Pancreatic Cancer Cell Proliferation by Targeting IL33

　　

吕梦洁|丁文静|周梦琳|向泰和|张道祥

中国合肥安徽医科大学生命科学学院

摘要

背景

胰腺导管腺癌是一种极具侵袭性的恶性肿瘤，目前现有的治疗手段对其效果仍较为有限。近年来，源自植物的类外泌体纳米囊泡被看作是具有潜力的天然纳米载体，能够跨生物界传递生物活性分子；不过，这类纳米囊泡在胰腺导管腺癌中的作用机制及其所携带的功能物质目前尚不明确。

方法

从绞股蓝中分离出类外泌体纳米囊泡，并通过纳米粒子追踪分析及ζ电位检测对其特性进行鉴定。采用PKH67荧光标记法检测细胞对这类纳米囊泡的摄取情况。通过小RNA测序和RT–qPCR技术筛选出与这类纳米囊泡相关的常见miRNAs。进而通过CCK-8试验和集落形成试验评估这类纳米囊泡以及miR-396b的生物学作用。通过转录组分析确定其下游靶标，再通过RT–qPCR、免疫印迹、生物信息学预测以及双荧光素酶报告基因试验验证IL33的作用。最后通过 rescue实验进一步研究miR-396b/IL33轴的功能作用。

结果

从绞股蓝中提取的类外泌体纳米囊泡可被胰腺癌细胞高效摄取，且能以剂量依赖的方式抑制细胞增殖。小RNA测序结果显示miR-396b是这类纳米囊泡中含量较高的功能物质。无论是应用这类纳米囊泡处理还是过表达miR-396b，都能显著降低IL33的表达水平。从机制上看，miR-396b会直接结合IL33的3′非翻译区，从而抑制报告基因的活性，而若突变该结合位点，则这种抑制作用会消失。功能 rescue实验表明，抑制miR-396b会减弱这类纳米囊泡带来的生长抑制作用，而重新表达IL33则可以部分逆转miR-396b过表达所引发的抗增殖效应，这说明miR-396b/IL33轴在这类纳米囊泡的生物学活性中起着重要作用。

结论

本研究确定miR-396b是来自绞股蓝的类外泌体纳米囊泡的主要功能物质，并证明这类纳米囊泡所携带的miR-396b至少可通过直接抑制IL39来发挥作用，进而抑制胰腺癌细胞的增殖。这些发现为了解跨生物界的类外泌体纳米囊泡–miRNA–IL33调控通路提供了机制层面的依据，也证明了源自植物的这类纳米囊泡有望作为用于治疗胰腺导管腺癌的生物活性纳米平台。不过，还有其他可能的纳米囊泡功能物质以及体内实验验证工作有待进一步开展。

引言

胰腺导管腺癌是全球范围内死亡率最高的恶性肿瘤之一，尽管外科手术、化疗以及靶向治疗都取得了进展，但其5年生存率依然很低^[1]。大多数患者在就诊时已处于疾病晚期或出现转移，仅有少数患者符合根治性切除的条件[2]，[3]。除了肿瘤本身具有高度侵袭性之外，胰腺导管腺癌中密集的间质组织以及极度抑制免疫功能的肿瘤微环境，也会限制药物输送、削弱抗肿瘤免疫反应，还会增加患者对免疫检查点阻断治疗的耐药性[4]，[5]，[6]，[7]，[8]。

天然产物及其衍生物一直是抗癌治疗的重要来源。近年来，源自植物的类外泌体纳米囊泡越来越受到关注，这类纳米载体具有生物相容性好、免疫原性低、稳定性高以及天然生物活性的特点。现有研究表明，植物来源的这类纳米囊泡可以被哺乳动物细胞摄取，能够携带多种分子物质，包括脂质、蛋白质以及小RNA，从而实现跨生物界的细胞信号传导和基因表达调控[9]，[10]。不过，目前尚未完全明确哪些具体的物质成分能够发挥抗肿瘤作用，以及它们在胰腺导管腺癌中的下游靶标是什么。

绞股蓝是一种在中国广泛使用的传统药用植物，已有研究显示它具有抗炎、抗氧化以及抗肿瘤作用^[11]。目前，已有大量研究聚焦于传统中药中的多酚类和黄酮类物质在癌症治疗中的作用[12]，[13]。虽然从绞股蓝中提取的成分或生物活性物质展现出一定的药理潜力，但目前还不清楚这类植物来源的类外泌体纳米囊泡是否可以直接抑制胰腺癌细胞的生长，如果可以的话，又是哪些纳米囊泡内的物质发挥了作用^[14]。

白介素-33属于IL-1细胞因子家族，已被证实与多种癌症的肿瘤进展、间质重塑以及免疫调节过程有关，其中包括胰腺导管腺癌^[17]。在胰腺癌中，与白介素-33相关的信号通路与炎症反应、纤维化以及免疫抑制性细胞的募集或活化有关，这说明白介素-33很可能是调控促肿瘤微环境形成的关键因素之一^[18]。因此，寻找能够抑制白介素-33表达的上游机制，或许能为胰腺导管腺癌的治疗提供新的思路。

在本研究中，我们首先从绞股蓝中分离并鉴定了类外泌体纳米囊泡，随后研究了它们在胰腺癌细胞中的生物学作用。通过整合小RNA测序、转录组分析以及功能验证，我们确定miR-396b是这类纳米囊泡中的一种重要miRNA，它能通过直接靶向白介素-33来抑制胰腺癌细胞的增殖。进一步的 rescue实验表明，miR-396b/IL33轴在发挥绞股蓝来源的类外泌体纳米囊泡的抗增殖作用中起着关键作用。这些发现揭示了一种此前未被认识到的跨生物界调控机制，也为将源自植物的这类纳米囊泡开发成用于治疗胰腺癌的优质天然纳米平台提供了理论依据。

内容节选

植物材料与组织培养

我们在实验室的无菌环境下培育绞股蓝的组织培养苗。将茎段接种在添加了0.5 mg/L萘乙酸和1.0 mg/L 6-苄基腺嘌呤的Murashige和Skoog固体培养基上，在25±2℃、16小时光照/8小时黑暗的光周期条件下培养4周。之后采集生长状况良好且无污染的茎和叶，用于提取类外泌体纳米囊泡。

类外泌体纳米囊泡的分离、纯化与特性鉴定

我们从绞股蓝中分离出类外泌体纳米囊泡，具体方法为

绞股蓝来源的类外泌体纳米囊泡可被胰腺癌细胞摄取并抑制细胞增殖

为了研究绞股蓝来源的类外泌体纳米囊泡的生物学功能，我们首先在受控条件下培育并维持无菌的组织培养植物苗。随后采集健康的茎和叶用于提取这类纳米囊泡（见图1a），整个实验流程如图1b所示。提取出的纳米囊泡随后经过特性鉴定，以确认其具备类外泌体的特征。纳米粒子追踪分析显示，这类纳米囊泡的尺寸分布为

讨论

在本研究中，我们证明了绞股蓝来源的类外泌体纳米囊泡对胰腺癌细胞具有很强的抗增殖作用，同时还发现了一种此前未被认识到的跨生物界调控机制，这种机制涉及这类纳米囊泡所携带的miR-396b及其下游靶标IL33。通过整合小RNA测序、转录组分析、分子验证以及 rescue实验，我们确定了miR-396b是绞股蓝来源的这类纳米囊泡的主要功能物质

CRediT作者贡献说明

丁文静：验证、研究、数据整理。 周梦琳：验证、研究。 吕梦洁：初稿撰写、可视化分析、验证、方法设计、研究开展、正式数据分析、数据整理。 向泰和：资源提供、资金筹集。 张道祥：文章润色与编辑、研究指导、资源提供、资金筹集、概念构思

未引用参考文献

[15]，[16]。

利益冲突声明

所有作者均不存在利益冲突。

资助情况

本研究得到了中国国家自然科学基金的资助（编号：82073372，82372682）。

利益冲突声明

所有作者均声明不存在任何利益冲突。

致谢

本研究中使用的K599质粒是由杭州师范大学向泰和教授及其研究团队提供的，我们对此表示衷心的感谢。