HSP90参与姜黄素(curcumin)介导的Tau蛋白聚集抑制效应

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：HSP90 is involved in curcumin-mediated inhibition of tau aggregation

　　

摘要：神经元内Tau蛋白聚集是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)的病理标志之一。目前针对包括AD在内的Tau蛋白病(tauopathy)中抑制Tau蛋白聚集的治疗药物研发仍具挑战性。研究人员建立了一套基于split Nanoluciferase(NLuc)的Tau自相互作用报告系统(Tau-NLuc)，当Tau蛋白间发生自相互作用使split NLuc重新组装时即可恢复荧光素酶活性。姜黄素(curcumin, CCM)可显著降低Tau-NLuc系统中的荧光素酶活性，包括已知易聚集突变体Tau S396/404E和P301L，提示CCM可能为Tau聚集潜在抑制剂。CCM不改变磷酸化Tau及总Tau蛋白水平，表明荧光素酶信号降低源于Tau聚集抑制而非Tau降解。值得注意的是，CCM显著增加了热休克蛋白(heat shock protein, HSP)90二聚体。使用HSP90特异性siRNA敲低HSP90基因或使用HSP90抑制剂NCT-58处理，均可恢复CCM在Tau-NLuc系统中降低的荧光素酶活性，证实HSP90参与其中。有趣的是，CCM的代谢衍生物六氢姜黄素(hexahydrocurcumin, HHC)既不能降低荧光素酶活性，也不诱导HSP90二聚体形成，提示HSP90二聚体形成可能参与CCM介导的Tau聚集抑制。综上，结果表明CCM在HSP90参与下抑制Tau聚集，为AD治疗策略开发提供了新见解。

论文解读：《Biochemical and Biophysical Research Communications》——HSP90参与姜黄素(curcumin)介导的Tau蛋白聚集抑制效应

一、研究背景与意义

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)及Tau蛋白病(tauopathy)的主要病理特征为神经元内微管相关蛋白Tau（特别是可溶寡聚体形式）异常自相互作用并形成神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)。目前尚无有效药物可特异性抑制Tau自相互作用及早期寡聚化。姜黄素(curcumin, CCM)作为一种多酚类化合物，既往体外研究显示其可抑制Tau纤维聚集并解聚Tau细丝，但其细胞内的确切作用机制尚未阐明。热休克蛋白90(Heat Shock Protein 90, HSP90)是细胞蛋白质质量控制的分子伴侣，可与Tau的微管结合区(microtubule binding region, MTBR)结合，但其对Tau聚集的确切作用存在争议。本研究旨在探明CCM在活细胞内抑制Tau自相互作用的机制，并明确HSP90在其中的角色。研究人员构建了基于NanoLuc? split荧光素酶的Tau自相互作用报告系统(Tau-NLuc)，发现CCM通过促进HSP90二聚体(dimer)形成并增强其与Tau共定位，从而抑制Tau自相互作用，且该效应不被其代谢产物六氢姜黄素(hexahydrocurcumin, HHC)所模拟。这一发现揭示了CCM抗Tau聚集的新机制，为AD药物研发提供了分子靶点依据。

二、主要关键技术方法

研究人员构建野生型及突变型(S396/404E、P301L)Tau及仅含MTBR(4R)区的Tau与NanoLuc split片段(N65及C66)融合表达载体(pHM6)，共转染HEK293及SH-SY5Y细胞建立Tau-NLuc自相互作用报告系统；采用不同浓度CCM或HHC处理细胞后检测相对荧光素酶活性(relative luminescence units, RLU)；通过免疫oblot检测总Tau、磷酸化Tau(pS396/S404, PHF1)、HSP90单体及二聚体、HSP70、HSP60、HSP40、β-actin水平；使用HSP90特异性siRNA敲低内源性HSP90或用HSP90抑制剂NCT-58验证功能必要性；过表达HA标签HSP90以确认二聚体形成；在SH-SY5Y细胞中共转染GFP-Tau与HA-HSP90，经CCM处理后行免疫荧光染色并用ImageJ进行像素共定位散点图分析及Pearson相关系数计算。

三、研究结果

3.1. Curcumin inhibits tau aggregation（姜黄素抑制Tau聚集）

研究人员将Tau-NLuc(WT、S396/404E、P301L、4R)共转染HEK293细胞，证实突变体型较WT产生更高本底荧光素酶活性，符合其更易自聚集特性。CCM处理呈浓度依赖性显著降低各型Tau-NLuc系统的RLU值，在SH-SY5Y细胞中亦得验证，且抑制效应强于非瑟酮(fisetin)。Western blot显示CCM处理12 h后总Tau及磷酸化Tau(PHF1表位)蛋白水平无变化，排除荧光素酶信号下降源于Tau降解，确证CCM抑制活细胞内Tau自相互作用/聚集。

3.2. HSP90 plays a crucial role in curcumin-mediated inhibition of tau aggregation（HSP90在姜黄素介导的Tau聚集抑制中起关键作用）

CCM处理使HSP90总蛋白量不变但非还原或还原条件下均可见明显HSP90二聚体(dimer)条带增强，HA-HSP90转染实验及SH-SY5Y细胞中均复现此现象。过表达HSP90本身即降低Tau-NLuc荧光素酶活性，与CCM联用抑制效应更强；反之，HSP90特异性siRNA敲低HSP90可部分回补(attenuate)CCM引起的RLU下降，HSP90抑制剂NCT-58同样削弱CCM效应。免疫荧光显示CCM处理显著增加GFP-Tau与HA-HSP90的共定位(Pearson's r升高)。结论：HSP90参与并介导CCM对Tau自相互作用的抑制，CCM通过促进HSP90二聚化及Tau–HSP90结合阻碍Tau聚集。

3.3. Hexahydrocurcumin does not reduce tau aggregation（六氢姜黄素不减少Tau聚集）

与CCM不同，其体内代谢物HHC在相同浓度下不能降低Tau-NLuc系统(WT、S396/404E、P301L)的荧光素酶活性(仅4R轻微无统计意义)，且不诱导HSP90二聚体形成。表明HHC缺乏CCM特有的促HSP90二聚化能力，无法抑制Tau自相互作用，提示CCM母核结构及α,β-不饱和羰基对HSP90二聚化及抗Tau聚集至关重要。

四、讨论与结论翻译

讨论指出，本研究利用活细胞Tau-NLuc系统证明CCM通过HSP90（尤其是其二聚体形式）参与抑制Tau自相互作用，而非通过促进Tau降解（总Tau及pTau水平不变）。HSP90二聚化增强Tau–HSP90共定位，可能通过分子伴侣作用屏蔽Tau的MTBR区域阻止其相互结合。HHC因不能诱导HSP90二聚体而无此效应。尽管HEK293及SH-SY5Y细胞系存在局限，Tau-NLuc系统因NanoLuc分子量小(19 kDa)、信号强，适用于Tau聚集调节化合物的高通量筛选。需在体内模型中进一步验证。

研究结论（翻译）：综上所述，本研究证明CCM主要在HSP90活化——特别是HSP90二聚体形成——的参与下抑制Tau自相互作用，而HHC不具备上述效应。这些发现凸显了HSP90在Tau聚集调控中的重要性，并为开发包括AD在内的Tau蛋白病的姜黄素类治疗策略提供了机制基础。