《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Bombyx mori p53 requires multiple domains for transcription-dependent apoptosis induction
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转录因子p53在脊椎动物和无脊椎动物中广泛保守，并调节包括凋亡在内的各种应激反应。在鳞翅目昆虫家蚕（Bombyx mori）和草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）中鉴定的p53蛋白（Bm-p53）通过瞬时表达表现出促凋亡活性；然而，鳞翅目p
转录因子p53在脊椎动物和无脊椎动物中广泛保守，并调节包括凋亡在内的各种应激反应。在鳞翅目昆虫家蚕（Bombyx mori）和草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）中鉴定的p53蛋白（Bm-p53）通过瞬时表达表现出促凋亡活性；然而，鳞翅目p53诱导凋亡的机制尚不清楚，特别是所需结构域和转录活性的作用。在这里，研究人员使用结构域/区域缺失突变体的瞬时表达试验研究了Bm-p53活性所需的结构域。Bm-p53包含三个结构域——转录激活结构域（TAD）、DNA结合结构域（DBD）和核定位信号（NLS）——这些结构域在哺乳动物和果蝇p53中保守。然而，Bm-p53缺乏在哺乳动物和果蝇p53的C末端区域保守的寡聚化结构域。研究人员发现所有检测的结构域/区域——TAD、DBD、NLS和C末端区域（CR）——对于Bm-p53的完全促凋亡活性至关重要。此外，Bm-p53可以从含有p53结合位点的启动子激活转录。这种活性在表达DBD、NLS和CR缺失的Bm-p53的细胞中完全丧失，而TAD缺失导致适度降低。对应于p53突变热点的点突变的Bm-p53的促凋亡和转录活性均被抑制。总之，研究人员的发现表明Bm-p53主要通过下游基因的转录激活诱导凋亡，需要通过NLS的核定位和通过DBD的DNA结合，并由TAD和CR支持。值得注意的是，非转录依赖机制也可能有助于凋亡诱导，表明Bm-p53功能存在更复杂的调控模型。
**研究背景与问题**
p53是一种高度保守的转录因子，在脊椎动物中调节细胞应激反应（如凋亡），但在无脊椎动物昆虫中的功能研究较少。家蚕（*Bombyx mori*）p53（Bm-p53）和草地贪夜蛾（*Spodoptera frugiperda*）p53（Sf-p53）在瞬时表达中显示促凋亡活性，但其作用机制，特别是所需结构域和转录活性的角色，尚不明确。此前研究表明，果蝇（*Drosophila melanogaster*）p53（Dp53）具有四个功能域（TAD、DBD、NLS和OD），而Bm-p53缺乏寡聚化结构域（OD），且其C末端区域（CR）的功能未知。此外，昆虫中缺失MDM2/MDMX调控轴的同源物，提示p53调控机制存在进化差异。本研究旨在通过域/区域缺失突变体瞬时表达分析，阐明Bm-p53诱导凋亡所需的结构域及其转录活性的关系，以揭示鳞翅目昆虫p53功能的保守性与特异性。
**研究内容与结论**
该论文发表在《Biochemical and Biophysical Research Communications》。研究人员使用家蚕卵巢来源的BM-N细胞系，构建了多种Bm-p53的域/区域缺失突变体（ΔTAD、ΔDBD、ΔNLS、ΔCR）及点突变体（R149H、R252H、R149H/R252H），通过瞬时表达系统，结合荧光显微镜定位、caspase-3活性检测和荧光素酶报告基因分析，系统评价了各结构域对Bm-p53促凋亡活性和转录激活能力的影响。主要结论：Bm-p53的完全促凋亡活性需要TAD、DBD、NLS和CR四个结构域/区域共同参与；Bm-p53能从含有人p53结合位点的启动子激活转录，该转录活性依赖于DBD、NLS和CR，而TAD缺失仅导致适度降低；对应于人类p53突变热点（R149H、R252H）的点突变完全消除了Bm-p53的转录和促凋亡活性。此外，Bm-p53ΔTAD保留微弱转录活性但无凋亡诱导能力，而Bm-p53ΔCR诱导凋亡却无检测到的转录活性，提示非转录依赖机制也可能参与。这些发现表明，Bm-p53主要通过转录依赖途径诱导凋亡，但非转录机制也被涉及，揭示了Bm-p53功能的复杂调控模式。
**主要技术方法**
1. **细胞培养与质粒转染**：使用家蚕BM-N细胞系（来源：Nagoya University实验室），采用FuGENE HD转染试剂进行瞬时表达。
2. **域/区域缺失及点突变质粒构建**：通过In-Fusion克隆和KOD-Plus-Mutagenesis试剂盒构建N端Egfp和HA双标签融合的Bm-p53野生型及突变体表达质粒。
3. **凋亡活性检测**：通过Hoechst33342核染色观察细胞形态，并结合caspase-3样蛋白酶活性测定（荧光底物Ac-DEVD-AMC）。
4. **转录活性分析**：使用含13个串联重复人p53结合位点的PG13-luc报告基因质粒，进行荧光素酶报告基因检测。
5. **蛋白质结构预测**：采用AlphaFold3在线服务器预测Bm-p53三维结构，结合InterProScan进行域注释。
**研究结果**
**3.1 瞬时表达的Bm-p53定位于细胞核**
通过荧光显微镜观察，Egfp融合的Bm-p53在BM-N细胞中主要定位于核内，且伴随caspase-3活性升高和凋亡形态发生，证实其核定位与促凋亡功能相关。
**3.2 完全促凋亡活性需要所有三个结构域和C末端区域(CR)**
分别缺失TAD、DBD、NLS和CR的突变体分析显示：ΔTAD、ΔDBD、ΔNLS完全丧失促凋亡活性（caspase-3活性与阴性对照相当）；ΔCR保留部分活性但显著低于野生型。细胞定位分析表明，ΔNLS分布于胞质，其余突变体仍定位于核内。这表明TAD、DBD、NLS和CR共同参与Bm-p53的凋亡诱导。
**3.3 Bm-p53从含有p53结合位点的启动子激活转录**
与PG13-luc共转染后，Bm-p53显著增加荧光素酶活性，而含突变结合位点的MG15-luc无此效应，证实Bm-p53具有转录激活能力。
**3.4 DBD、NLS和CR对Bm-p53的转录活性至关重要**
报告基因分析显示：ΔDBD、ΔNLS、ΔCR的荧光素酶活性均降至背景水平，而ΔTAD活性仅部分降低（仍显著高于阴性对照），表明DBD、NLS和CR是转录激活的必需元件，TAD起辅助作用。
**3.5 对应p53突变热点的点突变R149H和R252H使Bm-p53失去转录和促凋亡活性**
将Bm-p53中对应于人类p53热点突变（R155H、K259H）的氨基酸替换（R149H、R252H）后，两种突变体均完全丧失转录激活能力和凋亡诱导能力，与DBD缺失表型一致，强调了这些残基在Bm-p53功能中的关键作用。
**讨论与结论**
讨论部分指出，Bm-p53主要通过转录依赖方式诱导凋亡，但转录活性并非唯一机制：ΔTAD保留转录活性却无凋亡，ΔCR诱导凋亡却无转录活性，提示非转录机制（可能涉及线粒体凋亡调节因子的直接相互作用）也存在。CR经AlphaFold3预测为高可信度的结构域，可能是一种新型功能域，参与四聚化或调控转录依赖与非依赖途径的平衡。此外，突变体蛋白积累水平高于野生型，可能与Bm-Mdm2调控的泛素化降解敏感性改变有关。
**结论翻译**：总之，研究人员的发现表明Bm-p53主要通过下游未知基因的转录激活诱导凋亡，该过程需要NLS介导的核定位和DBD介导的DNA结合，并由TAD和CR支持；同时，非转录依赖机制也可能参与，提示Bm-p53功能存在更复杂的调控模型。
