一种用于监测铜死亡过程中氧化还原状态和微观粘度的近红外双功能化学传感器

《Bioorganic Chemistry》：A NIR dual-functional chemosensor for monitoring the redox level and micro-viscosity during cuproptosis process

　　

马俊岩|张宇哲|郭志山|孔祥涛|孟丹|何丽|张振星

中国河南省安阳市安阳师范学院新型光电子功能材料河南省重点实验室，安阳455000

摘要

最近被发现的铜介导的细胞死亡途径——铜凋亡，其特征为线粒体功能障碍、活性氧水平升高以及蛋白质聚集。准确评估这一过程中的活性化学物质及细胞微环境的变化对于阐明其内在机制至关重要。在此，我们描述了一种双功能荧光传感器YTO的合理设计与应用，该传感器可通过独立的荧光通道同时监测次氯酸（HOCl）和细胞内粘度。该探针对HOCl具有极高的特异性，响应速度快，检测下限低（16?nM），且在生理条件下稳定性优异。其粘度检测功能基于扭曲分子内电荷转移机制，而HOCl识别则依赖于氧化引发的分子内电荷转移抑制作用。关键的是，YTO能够实时成像铜诱导的细胞凋亡过程中的氧化应激与粘度变化。我们的研究结果表明，铜凋亡会导致氧化应激水平上升，并强调了在细胞内铜离子浓度足够时，谷胱甘肽在调节这种细胞死亡方式中的关键作用。这种双参数探针为研究活体系统中铜平衡、氧化还原状态及微环境参数之间的复杂相互作用提供了有力工具。

引言

作为一项重要的物理化学参数，粘度会对多种细胞活动产生深远影响，包括扩散运输、酶催化、多肽折叠以及细胞器功能[1]、[2]、[3]。在线粒体中，微粘度在调控氧化磷酸化、代谢物转运以及氧化还原平衡方面起着至关重要的作用。线粒体粘度的异常变化与多种病理状况有关，如神经退行性疾病、炎症反应以及代谢综合征。因此，准确量化并成像细胞粘度对于理解机体稳态调节及疾病成因极为重要[4]、[5]、[6]。

活性氧是氧化损伤及信号转导级联反应中的关键介质[7]、[8]、[9]。次氯酸（HOCl/ClO^?）是一种强氧化剂，主要通过髓过氧化物酶催化过氧化氢和氯离子反应生成，在正常情况下可通过中和入侵病原体来发挥先天免疫作用[10]、[11]、[12]。然而，若次氯酸生成失控，则会对其它分子如脂质、蛋白质和遗传物质造成氧化损伤，进而引发炎症性疾病、心血管功能障碍以及肿瘤发生。无论是次氯酸水平过低还是过高，都会损害细胞完整性，这就凸显出开发精确的细胞内定量方法的必要性[13]。越来越多的证据表明，氧化应激与细胞微粘度的变化之间存在密切关联[14]、[15]、[16]。粘度的变化会影响活性氧如次氯酸的移动性[17]、[18]、分散程度及反应性，从而调控对氧化还原状态敏感的信号网络[19]、[20]、[21]。因此，同时检测次氯酸与粘度能为理解与氧化应激相关的病理机制提供更全面的视角。

铜凋亡是一种由铜积累引发的程序性细胞死亡新形式[22]、[23]、[24]。与细胞凋亡、铁死亡或坏死不同，这种死亡途径是由细胞内铜过量引起的，且与线粒体代谢以及脂质化蛋白的聚集密切相关（见图1）。过量的铜会打破氧化还原平衡，加剧活性氧的产生，最终导致氧化损伤及线粒体功能受损[25]、[26]、[27]。尽管人们对铜凋亡越来越感兴趣，但这一过程中活性氧及微环境粘度的变化情况仍缺乏深入研究。（见图2。）

荧光探针是观察活体生物体内生化事件的强大工具[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]、[41]、[42]、[43]、[44]、[45]、[46]、[47]、[48]、[49]。虽然已有几种可用于单独检测次氯酸或粘度的传感器，但能够同时独立报告这两种参数的双响应型传感器仍然十分少见[50]、[51]、[52]、[53]、[54]、[55]、[56]。目前许多探针都采用单通道的“开启-关闭”响应模式，这使它们容易受到外界因素的影响，限制了其定量准确性。因此，开发能够同时检测次氯酸与粘度的双通道或比率型探针显得十分必要。

在本研究中，我们报道了YTO这一荧光传感器的研发过程，它是一种基于苯并噻嗪结构的探针，结合了受氧化状态调控的分子内电荷转移机制与对粘度敏感的扭曲分子内电荷转移调控机制。该探针可通过硫原子氧化实现对HOCl的选择性识别，同时通过限制分子内运动来检测粘度变化。通过全面的光谱分析、机制研究以及在细胞模型和斑马鱼中的生物成像应用，我们证实YTO是一种高效且多功能的工具，可用于研究铜凋亡过程中的氧化应激及微粘度动态变化。

章节节选

基本信息

仪器设置及相关分析方法详见补充信息。详细的合成路线、纯化流程以及表征数据（¹H NMR、¹³C NMR、HRMS）也可在补充信息中找到。

探针的合成

探针YTO：

(E)-5-氨基-3-(((10-甲基-10H-苯并噻嗪-3-基)亚甲基)氨基)噻吩-2,4-二氰化物。

原料包括10-甲基-10H-苯并噻嗪-3-甲醛（128?mg，0.5?mmol）、3,5-二氨基噻吩-2,4-二氰化物（82?mg，0.5?mmol）以及0.05?mL哌啶。

探针设计及工作原理

由于苯并噻嗪结构中的硫原子和氮原子具有富电子特性，我们选择它作为构建探针的核心骨架。该苯并噻嗪单元可作为有效的电子供体，促使传感器分子内部发生分子内电荷转移。因此，未经过修饰的YTO探针会发出红色荧光，其量子产率约为0.42。这种荧光源于与分子内电荷转移激发态相关的有效非辐射衰减路径。

结论

总之，我们成功开发了一种双响应型荧光传感器YTO，它可以通过不同的机制同时检测次氯酸与粘度。该探针具有极高的选择性、快速的响应速度、较低的检测下限，且在生理条件下稳定性良好。与以往报道的双响应型荧光传感器相比（见表S3），YTO具有多项显著优势，包括：（i）对HOCl具有高选择性和高灵敏度，且

补充数据

补充材料

CRediT作者贡献说明

马俊岩：撰写——审稿与编辑，指导工作。张宇哲：正式分析，数据整理。郭志山：正式分析，数据整理。孔祥涛：软件应用，正式分析。孟丹：正式分析，数据整理。何丽：正式分析，数据整理。张振星：撰写——初稿撰写，指导工作。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本研究得到了以下机构的财政支持：中国国家自然科学基金（编号：22407004）；河南省自然科学基金（编号：242300421613）；河南省教育厅科技研究重点项目（编号：23A150040、23A210024）；安阳市科技计划项目。