源自奥斯托醇的选择性AKR1C3抑制剂的结构设计与理性设计及其细胞活性研究

《Bioorganic Chemistry》：Rational design and structural insights of Osthole-derived selective AKR1C3 inhibitors with cellular activity

　　

Xuehua Zheng|Ping Huang|Jing Mi|Yundan Xiao|Li Zheng|Huiling Wang|Xiaoci Luo|Ruoxuan Liu|Jianye Zhang|Mingna Sun

中国广州市511436，广州医科大学药学学院及附属中医院，分子靶点与临床药理学广东省重点实验室、广州市重点实验室，国家药品监督管理局，呼吸系统疾病国家重点实验室

摘要

醛酮还原酶1C3（AKR1C3）是雄激素生物合成的关键酶，也是去势抵抗性前列腺癌（CRPC）发展的重要驱动因素，因此成为极具潜力的治疗靶点。若意外抑制其同源异构体AKR1C1和AKR1C2，则可能产生非靶向效应，极为不可取。在本研究中，我们以天然产物奥斯托尔为起点，通过优化C8位和C7位的取代基，分别作用于SP1和SP2口袋，合理设计了选择性AKR1C3抑制剂，从而实现了对AKR1C3的高选择性。在所合成的化合物中，有11种对AKR1C3具有强抑制作用（IC??＜0.1μM），且对AKR1C1的选择性很高。值得注意的是，化合物7k和7o在22Rv1细胞中表现出显著的抗增殖活性（IC??分别为3.05μM和5.45μM）。晶体学分析表明，香豆素核心结构可锚定在氧阴离子位点，而C8位取代基则与SP1口袋相互作用，进而提升了药物的效力与选择性。与其他基于香豆素的抑制剂不同，具有较长C8取代基的奥斯托尔衍生物以一种独特的方式与SP1口袋结合。这些研究结果验证了我们通过增强SP1口袋结合来提高AKR1C3选择性、降低其他AKR1C异构体影响的设计策略，同时也为进一步开发选择性AKR1C3抑制剂、用于治疗CRPC提供了重要的结构依据。

引言

醛酮还原酶1C3（AKR1C3），也被称为17β-羟基类固醇脱氢酶5型（17β-HSD5，HSD17B5）或3α-羟基类固醇脱氢酶2型（3α-HSD2），是一种依赖NADPH的羟基类固醇脱氢酶，属于醛酮还原酶超家族[1]。越来越多的证据表明，AKR1C3与多种癌症的发生发展有关，尤其是激素依赖性癌症，如前列腺癌和乳腺癌中的作用更是备受关注[2][3]。它能够催化5α-雄甾烷二酮还原为5α-二氢睾酮（DHT），同时将雄甾烷二酮转化为睾酮，从而促进雄激素的内源性合成，为前列腺癌细胞的生长和存活提供支持，因为这些细胞依赖于雄激素受体（AR）的信号传导[4]。此外，AKR1C3还能将前列腺素中间体如PGH?转化为PGF?α，将PGD?转化为9α,11β-PGF?，因此它也参与了炎症反应和细胞增殖信号通路的调控[5]。在激素敏感组织中，AKR1C3会促进炎症反应以及激素驱动的细胞增殖。在去势抵抗性前列腺癌（CRPC）中，已有研究显示AKR1C3的过表达会促进局部雄激素的合成，即便全身雄激素水平已下降，仍能维持AR信号传导。另外，AKR1C3还会导致对新一代抗雄激素药物的产生耐药性，这类药物旨在阻断雄激素的合成及受体信号传导，包括阿比特龙和恩杂鲁胺等[6][7][8][9]。因此，AKR1C3是克服CRPC药物耐药性、改善临床疗效的极具潜力的治疗靶点[10][11]。

在AKR1C家族的四种高度同源的亚型中，AKR1C3与AKR1C1和AKR1C2的序列相似度高达86%[12]。由于AKR1C1和AKR1C2也参与DHT的失活过程，因此要想在CRPC治疗中取得良好效果，就必须选择性地抑制AKR1C3[13]。为此，人们已经付出了大量努力来研发选择性AKR1C3抑制剂，其中包括羧酸衍生物以及一些非羧酸类化合物[5][14][15][16][17][18]。其中，ASP9521（A，CRPC相关的NTC01352208）[19]和BAY-1128688（B，NCT03373422，用于治疗子宫内膜异位症）[20]，都已经在临床试验中进行了评估。然而，这两种化合物都没有取得临床成功（见图1）：ASP9521未能显示出可测量的治疗效果[21]，而BAY-1128688则存在剂量依赖性的肝毒性[22][23]。这些临床转化方面的挑战凸显出，亟需研发出兼具高选择性和更好安全性的AKR1C3抑制剂，从而为下一代药物的设计提供参考。

香豆素衍生物因其结构多样性、合成灵活性以及良好的药物特性，包括优良的药代动力学参数和较低的毒性，成为药物研发领域极具吸引力的结构基础。正因如此，香豆素结构在药物化学中被视为一种优势结构，其广泛的潜在治疗应用，尤其是在抗癌治疗领域的应用，也已有大量研究综述[24][25][26]。近年来，基于香豆素的化合物也作为非羧酸类的AKR1C3抑制剂受到了广泛关注（见图1）。Endo S.及其团队发现了几种带有较大C3取代基的香豆素类似物，它们具有很强的AKR1C3抑制活性，其中化合物C对AKR1C3的选择性是相对于AKR1C1和AKR1C2的200多倍[27]。Jonnalagadda等人报告称，化合物D和E均为香豆素-3-羧酰胺类物质，它们不仅对AKR1C3和AKR1C2具有强抑制作用，还具备良好的药物特性，如在人体和小鼠肝脏微粒体以及血浆检测中都具有较好的代谢稳定性和半衰期[28]。此外，通过虚拟筛选还发现了一种带有较大C4取代基的香豆素抑制剂（F），它也对AKR1C3具有显著的选择性。这些化合物不仅在体外能够抑制前列腺癌细胞的增殖，与化疗药物联合使用时还能产生协同效应[29]。不过，目前有一系列带有较大C3取代基的香豆素衍生物对AKR1C3的选择性仍然有限，这再次体现了研发高选择性该亚型抑制剂的难度。

在本研究中，我们着眼于带有较大C8取代基的香豆素衍生物，这是一种对奥斯托尔进行改造的较少被研究的途径。奥斯托尔是一种具有生物活性的植物来源香豆素，主要来源于Cnidium monnieri（L.）植物，由于其多种治疗功效，尤其是对多种癌症的显著抗肿瘤活性，早已引起了众多科学家的兴趣[30][31][32]。我们的研究结果表明，这些C8取代衍生物对AKR1C3具有强抑制作用，且对AKR1C1的选择性很高。晶体学分析显示，奥斯托尔结构之所以对AKR1C3具有高效力和高选择性，是因为其独特的空间构型——它的吡喃环可以锚定在氧阴离子位点，同时将C8取代基引导至亚口袋1（SP1）中，这种结合方式与C3或C4取代基的香豆素截然不同。此外，这些化合物在22Rv1前列腺癌细胞中也展现出良好的抗增殖活性，说明它们有望成为有效的癌症治疗抑制剂。我们的研究结果提示，C8取代的香豆素结构有望作为研发选择性AKR1C3抑制剂的重要基础。

章节节选

作为AKR1C3抑制剂的奥斯托尔衍生物的设计与合成

AKR1C3的活性位点包含一个类固醇结合通道、一个氧阴离子位点，以及三个亚口袋（SP1、SP2和SP3）。氧阴离子位点由NAD(P)H辅因子的烟酰胺环以及催化残基Y55和H117共同构成，它对于将含有酮基、羧基或羟基的配体固定在靠近辅因子的位置至关重要[13][33][34]。这些亚口袋则能进一步稳定配体的结合状态，并影响不同亚型的选择性，其中SP1尤为重要，因为它

结论

综上所述，我们设计并合成了多种类C8和C7位点经过修饰的奥斯托尔衍生物，用作选择性AKR1C3抑制剂。C8位点的结构修饰对抑制剂的效力和亚型选择性有着至关重要的影响。在酰胺类衍生物中，像3p（N,N-二丙基）和3t（哌啶甲基）这样的叔酰胺类化合物，其IC??值处于亚微摩尔级别，且对AKR1C1的选择性也很高。将3p与AKR1C3共结晶后可以发现，香豆素核心结构能够锚定在氧阴离子位点上

化学合成

所有市售试剂和无水溶剂均按其原始状态直接使用。奥斯托尔是从上海麦克林生化科技有限公司购买的。分析用薄层色谱实验则使用的是上海浩鸿生物医药科技有限公司生产的、涂有荧光硅胶GF254的玻璃背板。样品斑点可在自然光下观察，也可分别在λ=254纳米和365纳米的紫外光下观测。纯化工作则是通过在硅胶柱上进行的

CRediT作者贡献说明

Xuehua Zheng：写作——审稿与编辑，写作——初稿撰写，可视化，监督，软件使用，方法设计，研究实施，资金获取，正式分析，数据整理，概念构思。Ping Huang：写作——初稿撰写，研究实施，数据整理。Jing Mi：写作——审稿与编辑，研究实施，数据整理。Yundan Xiao：研究实施，数据整理。Li Zheng：数据整理。Huiling Wang：研究实施。Xiaoci Luo：研究实施。Ruoxuan Liu：写作——审稿与

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了广东省基础与应用基础研究基金（编号：2022A1515010040）、广州市教育局2024年度高校科研项目（编号：2024312183），以及广州医科大学科学研究能力提升项目（编号：02-410-2405014）的支持。