1,4-二羟基-1,8-萘啶酮（DHN）类似物作为HIV-1逆转录酶相关RNase H抑制剂

《Bioorganic Chemistry》：1,4-Dihydroxy-1,8-napthyridinone (DHN) analogs as HIV-1 reverse transcriptase-associated RNase H inhibitors

　　

Muhammad Syafiq Bin Shahari|Samuel Offei|Huanchun Zhang|Janani Prahlad|Jacob P. Mahoney|Karen A. Kirby|Stefan G. Sarafianos|Zhengqiang Wang

美国明尼苏达州明尼阿波利斯市明尼苏达大学学术健康中心药物设计中心，邮编55455

摘要

逆转录酶相关的RNase H（RNH）仍是HIV-1中唯一尚未有药物针对的病毒编码酶功能。此前我们已开发出1,4-二羟基-1,8-萘啶酮（DHN）类似物，这类物质可作为正痘病毒分解酶的强效抑制剂，而这类分解酶属于具有双金属依赖催化机制的RNase H样（RNHL）核酸酶家族。在这项研究中，我们将现有的DHN化合物库扩展到82种类似物，并在HIV-1的体外实验及抗病毒检测中进行了测试。在针对逆转录酶的生化检测中，大多数类似物都能以低纳摩尔到亚微摩尔的浓度抑制RT RNH活性，而对逆转录酶聚合酶的活性则几乎没有抑制作用。结构-活性关系分析表明，C-3位带有苯基且C-5位有不同取代基的类似物具有最强的抑制效果。去除N-1位的羟基会显著减弱对RNH的抑制作用，这一现象与双金属螯合药效团有关。在针对HIV-1病毒的细胞水平抗病毒检测中，许多类似物表现出亚微摩尔的抗病毒活性，且无明显细胞毒性。最后，这些类似物还被用于检测同样属于RNHL家族的HIV-1整合酶链转移活性。虽然有些类似物的IC₅₀值处于低到中等微摩尔范围，能够抑制整合酶活性，但其抗病毒活性似乎与对RT RNH的抑制作用更为相关。

引言

人类免疫缺陷病毒（HIV）为自身复制需要编码三种关键酶：逆转录酶（RT）、整合酶（IN）和蛋白酶（PR）[1]、[2]，这些都是HIV药物的重要靶点。尤其是逆转录酶，它包含两个不同的功能结构域：一个负责RNA依赖性和DNA依赖性病毒DNA聚合的聚合酶结构域；另一个则在RNA依赖性DNA聚合过程中水解RNA/DNA杂链中的RNA链的RNase H结构域[3]。目前所有经FDA批准的核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）和非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）都针对的是逆转录酶的聚合酶结构域，而针对功能上至关重要的RNH结构域的小分子抑制剂至今仍未进入研发阶段，这既体现了开发此类新类型HIV药物的挑战，也暗示了其中的机遇。我们一直致力于开发结构新颖的活性位点RNH抑制剂，以克服底物主导所带来的生化障碍[4]。此外，也有研究报道了变构抑制剂[5]、[6]以及多功能抑制剂[7]、[8]。

从结构和催化机制上看，HIV的RNH属于依赖双金属的病毒核酸酶家族。病毒会编码多种核酸酶，通过切割核酸链内的磷酸二酯键（内切核酸酶）或从链端进行切割（外切核酸酶）来执行各种重要功能[9]、[10]。依赖金属的病毒内切核酸酶通常利用两种不同的活性位点结构来协调两个二价金属离子，如Mg²⁺或Mn²⁺，以实现催化功能：一种是存在于RNase H样（RNHL）超家族中的DEDD结构域[11]，以HIV-1的RNH为例[3]，该结构域也出现在HIV-1整合酶中，表现为DDE结构域[12]；另一种则是存在于DEK家族中的DD/E-X-K活性位点结构域[13]，例如流感病毒PA内切核酸酶这种能够切除病毒帽结构的酶[14]。目前，已有五种HIV-1整合酶链转移抑制剂（INSTIs），即拉替格韦(1) [15]、艾伏格韦(2) [16]、多替拉韦(3) [17]、比克替拉韦(4) [18]、卡博替拉韦(5) [19]，以及一种流感A病毒PA内切核酸酶抑制剂巴洛沙韦马boxil(6) [20]获得了FDA批准（见图1），这意味着RNHL家族和DEK家族的酶结构都已得到验证，可用于抗病毒药物的开发。这些获批药物的药效团核心都包含一个能够结合两个二价金属离子的螯合三联体（以红色标出）。

此前有一种非常有趣的双金属药效团，即1-羟基-1,8-萘啶酮金属螯合核心，曾被报道可作为HIV-1 RNH抑制剂[21]。最近，我们开发了一个属于同一化学类型的化合物库，即1,4-二羟基-1,8-萘啶酮（DHN），其中包含一些此前未被发现的类似物，这些类似物被证明是正痘病毒分解酶的强效抑制剂[22]。由于分解酶和RT RNH都属于RNHL家族，且具有相似的抑制剂药效团[11]，我们认为这个化合物库很可能会带来高效的HIV-1 RT RNH抑制剂。为了验证这一假设，我们首先将现有的DHN化合物库扩展到82种类似物，随后对其对RT RNH和逆转录酶聚合酶活性的影响进行了生化评估。大多数类似物还在针对HIV-1的细胞水平抗病毒检测中进行了测试。最后，那些具有较强抗病毒活性的类似物还被用于我们自主研发的整合酶链转移活性检测中，以便进一步分析其作用机制（见图2）。

章节节选

DHN化合物库的扩展

经过扩展后的含有82种类似物的DHN化合物库被分为8型和9型两大亚型。8型又包含四个子系列：8a-c系列中，C-3位分别带有苯基（芳香环）(8a，R¹?=?Ph）、乙基（烷基）(8b，R¹?=?Et）或氢原子（无取代）(8c，R¹?=?H），同时C-6位还有多种不同的取代基；而8d系列则是在C-5位具有不同的取代基。9型化合物库的构建旨在研究两种关键的药效团特征，即羟基

结论

我们构建了一个含有金属螯合三联体的DHN类似物化合物库，并对其针对HIV-1逆转录酶相关RNH活性的抑制效果进行了测试。在生化检测中，这些类似物能在低纳摩尔到亚微摩尔浓度范围内选择性地抑制RT RNH活性，而在10?μM浓度下对逆转录酶聚合酶的活性则几乎没有抑制作用。那些C-3位带有苯基且C-5位有不同取代基的类似物，具有最强的RNH抑制效果。去除N-1位的羟基后，则会完全丧失对RNH的抑制作用

化学部分

这些类似物的合成方法是依据之前发表的文章[22]中描述的步骤进行的。除特别说明外，所有试剂均为市售产品。干燥溶剂（THF、Et₂O、CH₂Cl₂和DMF）都是在充满氩气的环境下，从装有两层中性氧化铝或分子筛填料的无水溶剂系统中抽取的。无水乙醇则购自Sigma-Aldrich公司。色谱分离则是在Teledyne Combiflash RF-200型仪器上，使用RediSep硅胶柱进行的

CRediT作者贡献说明

Muhammad Syafiq Bin Shahari：文章撰写——审阅与编辑，文章撰写——初稿撰写，实验验证，软件应用，方法设计，实验研究，正式数据分析，数据整理。Samuel Offei：实验验证，方法设计，实验研究，正式数据分析，数据整理。Huanchun Zhang：实验验证，方法设计，实验研究，正式数据分析，数据整理。Janani Prahlad：方法设计，实验研究，数据整理。Jacob P. Mahoney：方法设计，实验研究，数据整理。Karen A. Kirby：文章撰写——审阅与

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究部分得到了美国国立卫生研究院的资助，项目编号为AI100890（资助对象为S.G.S.和Z.W.），同时还得到了明尼苏达大学药物设计中心的支持。S.G.S.还获得了Nahmias-Schinazi杰出研究主席基金的资助。