真菌与植物蛋白酶对扩展莫尼茨绦虫（Moniezia expansa, Anoplocephalidae）的杀卵效力比较

《Parasitologia》：Comparative Ovicidal Efficacy of Fungal and Plant Proteases on Moniezia expansa (Anoplocephalidae)

　　

莫尼茨绦虫病（monieziosis）对畜牧业构成重大挑战，主要由于寄生虫对常见驱虫药（anthelmintics）产生耐药性，从而需要替代控制策略。本研究检查了两种酶源（植物和真菌）对扩展莫尼茨绦虫（Moniezia expansa）卵结构完整性的体外效果，旨在寻找新的环境管理解决方案。植物酶木瓜蛋白酶（papain）在不同浓度和时间点进行了测试，而真菌酶通过固体发酵（solid-state fermentation）使用Duddingtonia flagrans（AC001）生产，得到活性粗酶提取物（active crude enzymatic extract, ACEE）。10%（w/v）木瓜蛋白酶显示出非线性降解（R² = 0.998），48 h后达到95%的卵减少。真菌提取物ACEE（71.2 U mL^?1）在72 h后引起60%的减少。形态学研究表明两种处理后均出现显著卵壳损伤。相容性测定显示拮抗作用，酶活性在48 h内降低83.83%，可能由于交叉蛋白水解（cross-proteolysis）。尽管每种试剂单独有效，但组合不可行。这是首次记录ACEE和木瓜蛋白酶对M. expansa卵活性的研究，并建议单独或序贯使用以实现有效寄生虫控制。

莫尼茨绦虫病（monieziosis）由扩展莫尼茨绦虫（Moniezia expansa）引起，对全球畜牧业尤其是巴西山羊和绵羊养殖造成显著经济损失。由于该寄生虫对常规驱虫药（anthelmintics）耐药性日益增强，且化学药物在环境中的残留带来生态风险，研究者迫切需要开发基于生物输入（bio-inputs）的替代控制策略。本研究聚焦于两种酶源——真菌Duddingtonia flagrans（AC001）产生的活性粗酶提取物（active crude enzymatic extract, ACEE）与植物源木瓜蛋白酶（papain），系统评估它们对M. expansa卵壳结构完整性的体外破坏能力，以期为环境友好型寄生虫管理提供生化基础。论文发表在《Parasitologia》。

研究采用的关键技术方法包括：从巴西维拉维拉大学实验寄生虫学与生物控制实验室自然死亡山羊体内获取M. expansa成虫，通过解剖孕节获得卵；真菌ACEE通过固体发酵（solid-state fermentation）生产，以预煮米和乳清为培养基，接种D. flagrans分生孢子（而非商品化厚垣孢子），10天后获得粗提液，并测定蛋白酶活性为71.2 U mL^?1，同时制备煮沸灭活的变性粗酶提取物（denatured crude enzymatic extract, DCEE）作为对照；植物酶使用商品木瓜蛋白酶粉末配制不同浓度（1%–20% w/v）。实验分为三部分：ACEE杀卵活性（暴露72 h和96 h）、木瓜蛋白酶浓度梯度筛选（72 h）及时间动力学（10%浓度，24–96 h），以及两者混合的相容性分析（0、2、48 h监测蛋白酶活性）。统计方法采用方差分析（ANOVA）、Tukey检验和多项式回归。

研究结果如下：
3.1.1 ACEE生产与蛋白酶活性：分生孢子接种的固体培养基成功诱导蛋白酶产生，活性达71.2 U mL^?1，而厚垣孢子接种未见蛋白酶活性，表明分生孢子更适于酶生产。
3.1.2 ACEE的杀卵活性：与对照组和DCEE组相比，ACEE在72 h后使完整卵减少60%（p < 0.01），96 h后减少54%（无显著差异），证实真菌粗酶具有显著卵壳破坏作用。
3.2.1 木瓜蛋白酶杀卵活性：浓度试验显示，10%、15%和20%（w/v）木瓜蛋白酶均显著降低完整卵比例（分别减少32%、48%和57%，p < 0.01），且三者间无显著差异，因此选择10%进行后续动力学实验；1%和5%则无显著效果。
3.2.2 卵完整性动力学：对照组卵自然降解缓慢，仅在96 h后降至57%（R² = 1）；而10%木瓜蛋白酶处理组在24 h内即出现急剧破坏，48 h后完整卵仅剩5%（R² = 0.9993），随后趋于稳定，表明木瓜蛋白酶能快速高效瓦解卵壳。
3.2.3 相容性研究：将ACEE与1%木瓜蛋白酶等量混合后，立即观测到35.08%的活性损失，2 h后损失39.15%，48 h后损失83.83%，呈现显著拮抗作用，其机制可能是两种蛋白酶互相识别为底物而发生交叉蛋白水解（cross-proteolysis）。

讨论部分指出，ACEE的杀卵活性（60%减少）优于文献报道的Paecilomyces lilacinus（19%–23%）及此前Silva等的结果（45.43%），证实固体发酵利用工业副产物乳清的策略具有生物技术优势。木瓜蛋白酶的高催化效率源于其半胱氨酸蛋白酶特性，能水解卵壳中富含角蛋白样蛋白的肽键，即使存在二硫键仍能导致结构崩溃。形态学观察（图5）直接显示两种酶处理后卵壳破裂、形状丧失。混合酶活性丧失的发现对生物制剂开发具有警示意义，未来应专注于酶稳定化或序贯施用策略。

结论部分翻译：本研究证实了D. flagrans的活性粗酶提取物（ACEE）与植物源木瓜蛋白酶均可作为M. expansa卵的有效体外控制剂。利用工业副产物优化真菌酶生产展现了可持续且经济可行的生物技术途径，以获取高活性提取物。此外，木瓜蛋白酶的快速催化作用（48 h内达最大效力）展示了其有效中断寄生虫生命周期、减少牧场污染的巨大潜力。另一重要发现是揭示了两类蛋白酶源之间存在显著拮抗作用，因此建议单独或序贯使用以保持催化完整性。本研究为家畜生产中环境友好型寄生虫控制策略奠定了生化基础，为传统驱虫药提供了可持续创新替代方案。