《Cardiovascular Pathology》：Proteomic profiling of whole tissue sections in cardiac ATTR amyloidosis reveals increased extracellular matrix remodeling
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心脏转甲状腺素蛋白淀粉样变（ATTR-CA）源于错误折叠的转甲状腺素蛋白（TThyretin, TTR）在心肌沉积，导致进行性心力衰竭。然而，疾病病理学不仅限于被动的淀粉样蛋白沉积，还涉及细胞外基质（ECM）重塑和免疫激活等主动过程。质谱（MS）技术是淀粉样蛋
心脏转甲状腺素蛋白淀粉样变（ATTR-CA）源于错误折叠的转甲状腺素蛋白（TThyretin, TTR）在心肌沉积，导致进行性心力衰竭。然而，疾病病理学不仅限于被动的淀粉样蛋白沉积，还涉及细胞外基质（ECM）重塑和免疫激活等主动过程。质谱（MS）技术是淀粉样蛋白分型诊断的金标准。本研究中，研究人员将定量MS驱动的蛋白质组学方法应用于6例ATTR-CA患者、10例未受影响对照者和4例轻链淀粉样变（AL-CA）对照者的甲醛固定石蜡包埋（FFPE）全心脏组织切片，以探究蛋白质表达变化。除TTR外，ATTR-CA活检组织中还有超过500种蛋白质上调，包括补体和凝血因子以及细胞外基质（ECM）重塑相关蛋白。其中，解整合素金属蛋白酶与血小板反应蛋白样基序（A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs, ADAMTS）家族成员、金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases, MMPs）以及金属蛋白酶组织抑制剂（Tissue Inhibitor of Metalloproteinases, TIMP3）均显示显著上调。这些蛋白质是ECM更新和结构完整性的关键调控因子。免疫组织化学（IHC）证实ADAMTS4在淀粉样蛋白沉积中富集，而TIMP3在心肌细胞中呈强表达，在淀粉样蛋白沉积中染色较弱。总之，这些发现表明，除补体和凝血激活外，ECM重塑也是心脏ATTR淀粉样变的一个可重复特征。全组织蛋白质组学提供了超越淀粉样蛋白分型诊断的生物学洞见，对ATTR-CA的生物标志物发现和治疗靶点探索具有潜在意义。
**研究背景与问题**
淀粉样变是一组以错误折叠蛋白质形成纤维并在细胞外沉积为特征的罕见疾病。转甲状腺素蛋白淀粉样变（ATTR）是迄今为止已鉴定出的约42种亚型中最常见的类型之一。生理条件下，TTR以稳定的四聚体形式循环于血液中，负责运输甲状腺素和维生素A；而在淀粉样变性过程中，四聚体解离为不稳定的单体，错误折叠并聚集成不溶性纤维，逐渐在组织中积累，主要累及心脏。ATTR分为两种形式：野生型（ATTRwt）和遗传变异型（ATTRv），均可导致射血分数保留的心力衰竭（HFpEF），预后差。研究显示，ATTRwt可导致舒张功能障碍，在老年HFpEF患者中占比高达13%。在细胞水平上，TTR纤维及其可溶性聚集体形式可直接产生细胞毒性，诱导心肌细胞氧化应激、钙 handling 失调和凋亡。与此同时，细胞外基质（ECM）重塑通过增加基质成分的沉积和更新而损害心肌弹性。金属肽酶及其抑制剂是ECM稳态和组织的关键调控因子，包括基质金属蛋白酶（MMPs）、解整合素金属蛋白酶（ADAM）家族、ADAMTS家族以及金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）。其中，TIMP3因其与ECM的强结合能力和广谱抑制特性而独树一帜，是心肌ECM完整性的关键保护因子。传统上，基于激光捕获显微切割（LCM）的质谱技术虽可实现精准的淀粉样蛋白分型，但无法捕捉淀粉样蛋白斑块周围细胞和ECM的变化。因此，研究人员开展此项研究，旨在通过全组织切片蛋白质组学分析，系统探究ATTR-CA中ECM重塑及相关病理过程的分子特征，以期超越单纯的诊断分型，深入理解疾病发病机制。
**主要技术方法**
本研究采用的关键技术方法包括：（1）样本获取：6例ATTR-CA患者、10例未受影响对照者（8例心脏移植术后正常组织、2例活检正常心肌）及4例AL-CA对照者的FFPE心肌活检组织，经刚果红染色和TTR免疫组织化学确认诊断；（2）蛋白质组学样本制备：采用基于十二烷基硫酸钠（SDS）增溶结合超声破碎的提取方案，经还原烷基化处理后，利用S-trap柱进行蛋白质捕获和胰酶（trypsin）消化；（3）液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析：采用数据非依赖采集平行累积串列碎片（DIA-PASEF）模式，在Evosep One液相色谱系统与TimsTOF SCP质谱仪联用平台上进行肽段分离和检测；（4）生物信息学分析：使用DIA-NN算法进行蛋白质鉴定和定量，R语言包进行无标记定量（LFQ）归一化、差异表达分析和缺失值插补，DAVID工具进行基因本体（GO）富集分析；（5）免疫组织化学验证：针对ADAMTS4和TIMP3进行抗体检测，在ATTR-CA患者A3的离体心脏组织及对照组织上进行表达定位验证。
**研究结果**
**定量蛋白质组分析**：研究人员对6例ATTR-CA、10例未受影响对照和4例AL-CA样本进行深入蛋白质组分析，共鉴定4,291种蛋白质，其中3,824种可定量。与未受影响对照相比，ATTR样本中519种蛋白质上调、75种下调。TTR在ATTR组中相对丰度最高，其他淀粉样特征蛋白如载脂蛋白E（ApoE）、载脂蛋白AIV（ApoAIV）和血清淀粉样P组分（SAP）也在ATTR样本中呈高丰度。
**TTR及淀粉样特征蛋白上调**：TTR在所有ATTR样本中均位于高丰度蛋白前列。除TTR外，溶菌酶C、载脂蛋白CIII、载脂蛋白AII、ApoAIV等淀粉样前体蛋白也显著上调。已知与系统性淀粉样变相关的其他纤维形成蛋白，包括免疫球蛋白轻链λ和κ、血清淀粉样蛋白A（SAA）、β2微球蛋白、载脂蛋白AI、凝胶溶蛋白和纤维蛋白原α等，在ATTR和健康样本中均有存在但无显著差异。
**功能注释与通路分析**：基因本体（GO）富集分析显示，ATTR-CA中上调蛋白主要涉及免疫和补体激活相关的生物学过程，以及ECM重塑相关的细胞组分和分子功能。
**补体和凝血因子的富集**：补体C1q亚基A、B、C（C1qA、C1qB、C1qC）在ATTR样本中显著上调。此外，C2、C4A和C4B、C6、C7、C8α/β/γ链、C9、C1R、补体因子D（CFD）和H（CFH）、以及补体因子H相关蛋白（CFHR）1、2、3、5均显著上调。在凝血通路方面，凝血因子X（F10）、VIII（F8）、XI（F11）、XII（F12），以及激肽释放酶B1（KLKB1）、组织因子通路抑制剂（TFPI）1和2、组织型纤溶酶原激活物（PLAT）等均上调，而血栓调节蛋白（THBD）下调。与AL-CA的对比分析显示，补体和凝血通路的上调在ATTR-CA中更为显著。
**ECM重塑因子的富集**：ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5及ADAMTS样蛋白3（ADAMTSL3）在ATTR样本中一致且显著上调；MMP19和MMP23B上调，同时TIMP3以及血小板反应蛋白2、3、4（THBS2、3、4）作为与MMPs相互作用的ECM组分也上调。多种胶原蛋白（COL3A1、COL5A1、COL6A1、COL8A1、COL12A1、COL14A1、COL16A1、COL18A1）及前胶原C-内肽酶增强子（PCOLCE、PCOLCE2）增加。此外，细胞外基质蛋白（ECM）1和2、组织蛋白酶F（CTSF）、溶酶体相关膜糖蛋白2（LAMP2）及基质重塑相关蛋白5（MXRA5）也上调。与AL-CA的扩展分析显示，ECM重塑因子的上调在ATTR中更为明显。
**ADAMTS4和TIMP3表达增加的验证**：免疫组织化学验证显示，在ATTR-CA病例中，TIMP3在几乎所有心肌细胞中呈强胞浆染色，在淀粉样蛋白沉积区域有较弱表达；而对照组织仅显示局灶性、总体较弱的染色模式。ADAMTS4在ATTR病例中于心肌细胞间的淀粉样蛋白沉积中呈强而均匀的染色，心肌细胞胞浆呈弱而均一的染色；对照组织仅显示微弱的局灶性染色。扩展分析表明，ADAMTS4在ATTR相较对照中的上调幅度大于AL相较对照，而TIMP3仅在ATTR中显著上调、在AL中不显著。
**淀粉样相关蛋白质组的异质性**：ATTR-CA组内存在样本间变异，3例样本（A2、A3、A6）较其他样本显示更广泛、更强烈的上调模式，涉及过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号、溶酶体活性和类固醇激素生物合成等代谢和应激相关通路。这种蛋白质组异质性与年龄、性别、基因型、TTR丰度或淀粉样蛋白负荷等临床参数无相关性。
**讨论、研究意义与结论**
研究人员讨论了ECM重塑在ATTR-CA中的核心作用。金属蛋白酶（MMP19和MMP23B）及其抑制剂TIMP3的上调符合淀粉样变中基质重塑的假说。此前Gottwald等和Kourelis等已注意到TIMP3在ATTR淀粉样蛋白沉积中的上调，本研究进一步证实TIMP3不仅存在于淀粉样蛋白斑块中，也在产生该蛋白的心肌细胞中表达。研究首次揭示了ADAMTS家族蛋白在ATTR-CA中的参与，ADAMTS1、ADAMTS4和ADAMTS5的上调提示其作用不限于脑淀粉样变。ADAMTSL3的上调也提示了ECM组织结构维持的广泛变化。胶原蛋白方面，多种胶原类型及前胶原处理因子的增加，与既往报道中胶原纤维包裹淀粉样纤维、保护其免受巨噬细胞降解的研究相一致，也与Netzel等报道的胶原水平升高与临床预后不良相关的发现相符。
补体系统激活方面，本研究发现的多组分上调与Lux等报道的C9在淀粉样沉积中的关键作用、以及Kourelis等的蛋白质组学证据相一致。Netzel等在全组织蛋白质组分析中也发现了补体通路富集，提示补体激活参与组织损伤和不良预后。值得注意的是，由于对照组织取自免疫抑制患者（心脏移植术后），补体上调幅度需谨慎解读。
凝血因子的显著增加是本研究的另一重要发现。Napolitano等曾指出ATTR淀粉样变患者存在凝血异常和血栓风险增加，可能与血管内淀粉样蛋白沉积和血管损伤相关。本研究中凝血与补体通路的共富集提示了两者之间的交叉对话，尽管其确切功能意义尚待阐明。
关于组内异质性，研究人员推测代谢和应激相关通路显著上调的病例可能代表疾病更活跃的阶段，而缺乏此类上调的样本可能对应疾病晚期，但这一假设需进一步研究验证。
研究强调了全组织切片蛋白质组学相较LCM的优势：在淀粉样蛋白负荷较低或活检样本较小的情况下，全组织分析可提供足够的诊断灵敏度，减少劳动密集型的LCM需求；同时，了解背景蛋白质组有助于病理学家更准确地解读质谱结果。研究也承认样本量较小、缺少非免疫抑制的非淀粉样性心肌纤维化对照组等局限性。
研究结论部分指出："对ATTR淀粉样变全组织切片的蛋白质组学分析揭示了ECM相关蛋白的显著上调，包括MMPs、ADAMTSs及其抑制剂TIMP3，同时伴有补体和凝血因子的上调。免疫组织化学证实了ADAMTS4和TIMP3在淀粉样蛋白斑块中的表达增加。这些发现强调，ECM重塑和蛋白酶-抑制剂动态变化是心脏ATTR淀粉样变的可重复特征，并为生物标志物开发和治疗干预提供了潜在方向。"
