人脐带间充质基质细胞来源的经炎症因子预处理的MSCs外泌体通过调节巨噬细胞极化减轻糖尿病小鼠肾损伤

《Clinical Science》：Human umbilical cord mesenchymal stromal cell-derived exosomes from MSCs pretreated with inflammatory factors attenuate renal injury of diabetic mice by regulating macrophage polarization

　　

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）的主要并发症，以严重的临床表现、生活质量受损以及进展至终末期肾病（ESRD）的高风险为特征，凸显了对有效治疗干预的迫切需求。间充质基质细胞来源外泌体（MSC-Exo）因其免疫调节特性，已成为减轻DN炎症损伤的有前景候选物，而来源于经炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）预处理的MSCs的外泌体可能具有增强的治疗潜力。在本研究中，研究人员通过透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析和蛋白质印迹法对人脐带MSCs分离的外泌体进行了表征。在糖尿病小鼠中评估了其治疗效果，重点关注肾脏炎症和巨噬细胞极化。正常MSC-Exo（Norm-Exo）和TNF-α&IFN-γ预处理的MSC-Exo（TNF-α&IFN-γ-Exo）均有效改善了肾损伤并促进了M2巨噬细胞极化，其中TNF-α&IFN-γ-Exo显示出更优的疗效。研究人员使用高糖刺激的RAW264.7细胞探索潜在机制，高通量RNA测序鉴定出DNA结合抑制因子3（ID3）是参与MSC-Exo调节巨噬细胞极化的分子。功能缺失实验证实，单独敲低ID3即可重现外泌体的效果，促进M2极化并抑制M1标志物。相反，ID3过表达减弱了外泌体的功效。机制上，ID3部分介导了外泌体诱导的核因子-κB（NF-κB）通路抑制。这些发现在佛波酯（PMA）分化的THP-1人巨噬细胞中进一步验证了其转化意义。综上所述，这些发现表明MSC-Exo——尤其是TNF-α&IFN-γ-Exo——通过ID3调控调节巨噬细胞极化来减轻糖尿病肾损伤，为DN治疗提供了一种新型无细胞免疫调节方法。

**论文解读**

**研究背景、存在问题及研究目的**

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）最严重的微血管并发症之一，常进展至终末期肾病（ESRD），患者生活质量严重下降且经济负担沉重，亟需阐明其发病机制并开发有效治疗手段。DM的两种主要类型——1型糖尿病（T1DM）和2型糖尿病（T2DM）均伴随系统性炎症，而肾脏局部和全身性炎症反应在DN进展中起核心作用，肾损伤严重程度与炎症强度密切相关。巨噬细胞作为关键固有免疫细胞，其浸润程度与DN严重程度显著相关，且具有高度可塑性，可极化为促炎型（M1）和抗炎型（M2）。在DN中，M1巨噬细胞加剧炎症，而M2巨噬细胞减轻免疫介导的损伤。因此，以巨噬细胞极化为靶点调节炎症的策略对DN治疗具有重要意义。间充质基质细胞（MSCs）因其组织修复和免疫调节双重能力而成为炎性疾病潜在治疗手段，其旁分泌作用——特别是通过分泌外泌体（MSC-Exo）——被认为是治疗获益的核心。与完整MSCs相比，MSC-Exo具有生化稳定性好、毒性低、易储存等优势。此外，用炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）预处理MSCs可增强其外泌体（TNF-α&IFN-γ-Exo）的免疫调节效力。然而，MSC-Exo如何通过调节巨噬细胞极化来影响DN炎症的具体机制仍不明确，且细胞因子预处理是否增强该效应尚不清楚。本研究旨在阐明这些问题，并鉴定出参与该过程的关键转录调控因子。该论文发表于《Clinical Science》。

**主要关键技术与方法**

研究人员首先通过差速超速离心法从人脐带MSCs（HUCMSCs）中分离出正常外泌体（Norm-Exo）和经TNF-α&IFN-γ预处理的外泌体（TNF-α&IFN-γ-Exo），并使用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）和蛋白质印迹法（WB）进行表征。在体内实验中，采用链脲佐菌素（STZ）诱导的T1DM小鼠模型（来源：吉林大学基础医学院动物中心），于造模12周后通过尾静脉注射外泌体（50 μg/只，每周两次，共5周），分别设置正常对照组（NC）、糖尿病组（DM）、DM+Norm-Exo组和DM+TNF-α&IFN-γ-Exo组，18周后处死动物收集脾脏和肾脏组织。体外实验使用高糖（35 mM）刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞和佛波酯（PMA）分化的THP-1人巨噬细胞。通过高通量唯一标识符（UID）RNA测序鉴定差异表达基因（DEGs），并进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。采用质粒转染进行ID3过表达，以及siRNA转染进行ID3敲低的功能实验。利用流式细胞术分析脾脏CD4⁺T细胞亚群（Th1, Th2, Th17, Treg）和肾脏巨噬细胞极化（M1: CD86⁺, M2: CD206⁺）。通过组织学染色（H&E, PAS, Masson）和免疫组化评估肾组织病理及炎症因子表达。使用WB和定量实时PCR（qRT-PCR）检测蛋白和mRNA水平。

**研究结果**

**（1）HUCMSC-Exo的表征**：TEM显示Norm-Exo和TNF-α&IFN-γ-Exo均呈典型球形双膜结构；NTA测得峰值粒径分别为184.4 nm和173 nm；WB证实两者均表达外泌体标志物CD9、CD63和TSG101，表明成功分离和表征了HUCMSC来源外泌体。

**（2）HUCMSC-Exo对T1DM小鼠常规指标的影响**：与DM组相比，Norm-Exo和TNF-α&IFN-γ-Exo均显著降低空腹血糖水平（TNF-α&IFN-γ-Exo效果更显著），TNF-α&IFN-γ-Exo显著增加体重（P<0.05）。两种外泌体均改善葡萄糖耐量（组间无显著差异），并减轻脾脏系数下降，但对肾脏系数无显著影响。

**（3）HUCMSC-Exo对T1DM小鼠CD4⁺T细胞及其亚型的影响**：流式细胞术显示，与NC组相比，DM组脾脏CD4⁺T细胞比例升高，且向促炎表型偏移（Th1和Th17升高，Th2和Treg降低）。两种外泌体处理部分逆转了这些变化，降低Th1和Th17，增加Th2和Treg，其中TNF-α&IFN-γ-Exo调节作用更显著。

**（4）HUCMSC-Exo减轻T1DM小鼠肾脏炎症并调节巨噬细胞极化**：两种外泌体均降低尿白蛋白肌酐比（UACR）（TNF-α&IFN-γ-Exo更优）。组织学显示，DM组肾脏出现炎症细胞浸润、肾小球基底膜增厚和胶原沉积，外泌体处理后改善。WB和免疫组化显示，DM组肾脏促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α升高，抗炎因子IL-10降低，外泌体处理逆转了这些变化。流式细胞术显示，DM组脾脏单核细胞比例增加，肾脏巨噬细胞向M1表型偏移；外泌体处理降低单核细胞比例，促进巨噬细胞向M2表型极化（TNF-α&IFN-γ-Exo对M2极化作用更显著）。相关性分析显示空腹血糖与UACR、IL-6、IL-1β、TNF-α呈正相关，与IL-10呈负相关。

**（5）MSC-Exo对高糖刺激的RAW264.7细胞具有极化调节作用**：体外实验中，高糖（35 mM）处理RAW264.7细胞48小时使M1标志物iNOS升高、M2标志物Arg1降低。Norm-Exo和TNF-α&IFN-γ-Exo均抑制iNOS并增强Arg1表达（TNF-α&IFN-γ-Exo效果更优）。甘露醇等渗对照排除了高渗效应。

**（6）UID RNA-seq揭示HUCMSC-Exo对高糖刺激RAW264.7细胞mRNA表达谱的影响**：RNA-seq鉴定出与HG组相比，HG+Norm-Exo组有291个差异表达基因（DEGs），HG+TNF-α&IFN-γ-Exo组有90个DEGs。GO和KEGG分析显示转录调控和炎症相关通路显著改变。ID3在HG+Exo和HG+TNF-α&IFN-γ-Exo组中表达下调（logFC分别为-0.67和-0.81，FDR均<0.05）。

**（7）ID3参与MSC-Exo介导的巨噬细胞极化**：qRT-PCR和WB验证了ID3在高糖组中升高，在外泌体处理后降低。ID3过表达实验显示，过表达ID3本身可模拟高糖诱导的M1偏斜（iNOS升高，Arg1降低）。在ID3过表达背景下，外泌体抑制iNOS和促进Arg1的能力减弱。ID3敲低实验显示，单独敲低ID3可逆转高糖诱导的M1表型（降低iNOS，升高Arg1），而联合TNF-α&IFN-γ-Exo处理仍产生进一步但减弱的改善效果。机制上，高糖增加p-p65水平，ID3敲低或外泌体处理可降低p-p65，且外泌体的抑制效果部分依赖于ID3。在PMA分化的THP-1人巨噬细胞中，ID3敲低显著降低高糖诱导的TNF-α和IL-6表达，并恢复CD206和ARG1水平。

**讨论与结论总结**

讨论部分指出，两种外泌体（尤其是TNF-α&IFN-γ-Exo）通过降低血糖和UACR、改善葡萄糖耐量、减轻全身及肾脏局部炎症、调节脾脏CD4⁺T细胞亚型和肾脏巨噬细胞极化，发挥肾保护作用。血糖改善可能继发于抗炎效应，而非直接保护胰岛β细胞。体外实验证实ID3是外泌体调节巨噬细胞极化的关键中介分子，部分通过抑制NF-κB通路实现。该机制独立于经典的MSC-Exo非编码RNA或炎症信号通路，为DN治疗提供了新的转录调控层面。

**研究结论翻译**：研究人员的发现表明，Norm-Exo和TNF-α&IFN-γ-Exo均能有效降低糖尿病小鼠的血糖水平和UACR，其中TNF-α&IFN-γ-Exo相比Norm-Exo表现出更优的治疗效果。此外，两种外泌体制剂均显著改善了糖尿病小鼠模型中的肾脏炎症反应，TNF-α&IFN-γ-Exo再次展现出更明显的抗炎作用。机制研究表明，CD4⁺T细胞、单核细胞和巨噬细胞共同参与Norm-Exo和TNF-α&IFN-γ-Exo在糖尿病小鼠中对肾脏炎症反应的调节。重要的是，该研究鉴定出ID3是一种参与外泌体在高糖条件下调节巨噬细胞极化的分子。实验证据表明，Norm-Exo和TNF-α&IFN-γ-Exo可能部分通过抑制ID3表达来调节高糖环境中的巨噬细胞极化，从而发挥对DN的治疗作用。