综述：超越结构：冷冻电子显微镜中的光谱成像

《Current Opinion in Structural Biology》：Beyond structure: spectroscopic imaging in cryogenic electron microscopy

　　

冷冻电子显微镜（cryo-EM）通过实现大分子的近原子分辨率成像以及直接在天然细胞环境中可视化分子结构，已经变革了结构生物学。然而，传统的冷冻电子显微镜虽然在阐明分子密度和形态方面表现出色，但提供的关于化学成分或分子状态的直接信息很少。在此，研究人员回顾了基于扫描和光谱电子显微镜的最新进展，这些进展将冷冻电子显微镜扩展到相位衬度之外，包括Z衬度成像（Z-contrast imaging）、能量色散X射线能谱（energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDS）和电子能量损失谱（electron energy-loss spectroscopy, EELS）。研究人员强调了这些技术如何在束敏感生物样本中实现元素分布和化学状态的无标记图谱绘制，并讨论了将光谱学与冷冻样品制备和相关成像相结合的新兴工作流程。总之，这些发展将光谱冷冻电子显微镜定位为一种连接分子和细胞尺度上的结构、组成和功能的强大方法。

**Structural resolution achieved, but chemical context lacking**
在过去的十年中，冷冻电子显微镜（cryo-EM）在分辨率和生物学适用范围方面均显著扩展。仪器、直接电子探测器和图像处理算法的进步将单颗粒cryo-EM推至近原子分辨率，即使是此前被认为过小的蛋白质（36–55 kDa）也可实现约2?的结构解析。同时，冷冻电子断层成像（cryo-ET）将结构分析从纯化分子扩展到天然细胞和组织中。玻璃化、聚焦离子束（focused ion beam, FIB）减薄和数据分析的改进，使研究人员能够直接在内含细胞、细胞器甚至多细胞标本中对大分子复合物进行精细解析。然而，单颗粒和断层成像cryo-EM均存在一个根本局限：图像衬度主要由相位衬度（phase contrast）主导，该衬度来源于电子被样品静电势散射的结果。因此，cryo-EM可解析分子密度和形态，但无法直接获取化学成分或分子状态的信息。致密特征可能来源于蛋白质、脂质、金属或矿化相，但在相位衬度图像中无法区分。由于生物功能不仅由分子结构排列决定，还受复杂相互作用和化学组分局部分布的影响，cryo-EM中化学信息的缺乏限制了其回答某些科学问题的能力。例如，微生物对全氟和多氟烷基物质等环境毒素的生物积累研究，需要定位特定元素以理解其机制。同样，由液-液相分离形成的生物分子凝聚体对局部离子环境高度敏感，仅靠形态学无法辨别。光谱学可用于确定凝聚体内部空间异质性如何反映局部组成差异（如离子分配或特定生物分子组分的相对富集）。荧光化学探针标记策略可部分解决这些问题，但可能扰乱天然结构，且光学显微镜的固有分辨率限制常不足以精确关联电子显微镜分析所需的特征。这些考量促使研究人员开发无需外源标记即可直接获取化学组成的替代衬度机制。

**Scanning electron imaging and the emergence of Z-contrast**
除广束电子照明外，成像也可在扫描模式下进行，主要实现方式包括扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）和扫描透射电子显微镜（scanning transmission electron microscopy, STEM）。两者均使用聚焦探针在样品上逐点扫描，同时探测器记录每个位置的发射电子（SEM）或透射电子（STEM）。这种扫描范式扩展了除相位衬度之外的衬度机制，可选择性地探测弹性散射和非弹性散射电子，将图像形成与质量密度解耦。近期研究表明，玻璃化细胞和组织可通过低温SEM（cryo-SEM）利用低电压二次电子探测进行有效成像，衬度主要反映表面电势和充电变化，从而在未染色、近天然状态下可视化富含轻元素的生物材料。将SEM成像与FIB减薄结合，可实现“切割-观察”体成像（mill-and-view volume imaging），生成细胞超微结构的纳米级三维重构。在低温条件下，cryo-FIB-SEM可直接操作玻璃化样品，并支持多尺度关联工作流程，其中体成像用于映射细胞环境并指导薄片的制备，以供后续cryo-ET分析。扫描电子成像的一个重要成果是原子序数（atomic number, Z）衬度，它来源于弹性卢瑟福散射（Rutherford scattering），随原子序数显著增强。由于生物样品大多为非晶态，衍射衬度效应极小，因此散射强度主要解释为成分差异而非晶体取向或通道效应。在SEM中，Z衬度通常通过背散射电子探测，并长期用于重金属染色的生物成像。虽然二次电子成像对轻元素（C、H、O、N）提供合理衬度，但P、S、Ca、Fe等较重元素常在特定细胞区域天然富集，这些元素产生增强的散射信号，因此可通过背散射电子成像中的Z衬度有效区分。例如，cryo-FIB-SEM Z衬度成像已基于钙和磷含量区分矿化软骨和骨小梁与周围软组织，清晰描绘了生长板-骨界面的尖锐成分边界，而仅凭形态学无法识别。STEM同样利用环形暗场（annular dark field, ADF）检测提供Z敏感成像，探测器几何和样品后透镜控制收集的散射电子角度范围。早期cryo-STEM研究表明，密集的细胞内区室（如玻璃化细菌中的多磷酸盐储存颗粒）可仅通过增强散射检测，提供无标记的元素富集识别。近期，4D-STEM（也称扫描电子纳米衍射，scanning electron nanodiffraction, SEND）作为一种分析束敏感材料的技术出现，通过在每个像素点采集衍射图案，同时获取空间和倒空间信息。4D-STEM还可实现叠层衍射成像（ptychography）和倾斜校正明场成像，已用于生物样品。从4D-STEM数据集中可提取虚拟暗场（virtual dark field, VDF）图像，通过后处理灵活选择散射角范围，以优化Z衬度图像的重建。例如，基于低剂量4D-STEM数据集的VDF成像成功重建了嵌入金属-有机框架中的金属纳米颗粒断层图像。尽管背散射电子和暗场成像提供剂量高效的化学区域定位，但缺乏元素特异性，因此Z衬度成像常作为后续光谱分析的简单补充指南，以定位可能产生信息信号的元素或化学差异区域。

**Spectroscopic cryo-EM imaging: from elemental mapping to chemical states**
基于扫描的成像易于实现生物样品的光谱分析，直接提供元素组成和部分化学状态信息。能量色散X射线能谱（energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDS）和电子能量损失谱（electron energy-loss spectroscopy, EELS）是低温、束敏感生物样品中应用最广泛的技术，各自具有独特优势和局限。EDS通过内壳层电离后发射的特征X射线识别元素：高能入射电子与样品相互作用，击出内壳层电子产生空穴，外层电子跃迁填充空穴时释放特征X射线。由于每种元素具有独特能级，这些特征X射线可作为元素识别的化学指纹。EDS在材料科学和地质学中常用，但在生物样品中因轻元素信号弱且需高电子剂量以达到可接受的信噪比而受限，因此最适用于映射相对丰富或高Z元素（如钙和磷），尤其在cryo-SEM或cryo-STEM工作流程中。在低温生物样品中，EDS映射已用于研究元素区室化，例如cryo-SEM-EDS检测到底栖有孔虫酸钙体中的大量磷酸盐积累，暗示这些微生物参与海洋磷循环；人生长板的空间分辨EDS映射揭示了与力学刚度和发育功能相关的极化钙和磷梯度。然而，EDS存在固有局限：轻元素的荧光产额低导致信号效率不足，高电子剂量易引起束损伤，且无法区分元素的化学状态（例如，蛋白质和脂质均由碳构成，但EDS无法区分肽键和双键）。EELS通过分析电子非弹性散射的能量损失来补充EDS：电子束穿透样品时与原子结构碰撞损失特定能量，谱仪记录透射电子的能量损失。内壳层电离能的元素特异性使核心损失边的位置直接识别元素，近边精细结构（near-edge fine structure）则包含化学键和配位环境信息，从而超越元素分析实现化学态确定。EELS具有三大优势：直接分析透射电子束，信号效率高；空间分辨率可达近原子级；对低Z元素异常敏感。EELS可在常规透射电子显微镜（TEM）和STEM中实现。在TEM中，能量过滤TEM（energy-filtered TEM, EFTEM）通过三窗口法进行元素映射（两个预边窗确定背景，后边窗扣除背景），适用于束敏感生物样品，例如利用Ce元素映射可视化LaccID标记的细胞结构，以及区分玻璃态冰中包裹的链霉亲和素包覆二氧化硅纳米颗粒的碳富集蛋白层与二氧化硅核心。但三窗口法每次仅能分析一种或少数元素，背景建模易产生外推误差。相比之下，STEM-EELS工作在谱成像（spectrum-imaging, SI）模式，在每个像素点采集能量损失谱，生成包含化学光谱信息的二维图像。全谱范围访问允许更复杂的背景建模，提高信号提取精度并减少伪影，同时可从单次数据集中提取多种元素信息。因此，STEM-EELS已成为标准方法，cryo-STEM-EELS越来越多地用于束敏感材料和生物样品。Pfeil-Gardiner等人成功将单颗粒分析工作流程适配于cryo-STEM-EELS，建立了重构电子能量损失（reconstructed electron energy-loss, REEL）分析。由于严格剂量限制（<100 e^-/?²）导致单个EELS谱极其微弱，他们通过去耦空间对准与光谱信号，利用高强度低损失图像精确估计颗粒位姿，再整合并平均多个颗粒的噪声能量损失谱，最终获得足以区分兔RyR1和蠕虫血红蛋白精细化学特征的信噪比。然而，实现单原子级灵敏度需更大数据集，当前数据采集受探测器速度限制，整个研究需数周仪器时间。将下一代高速直接电子探测器集成至系统，对于扩大数据集、提高对准精度和显著提升元素灵敏度至关重要。同时，Wu等人通过cryo-STEM-EELS与断层成像工作流程，确定视盘玻璃疣中线粒体以磷酸钙形式积累沉淀物。历史上，由于所需高电子剂量（>10⁷ e^-/?²）会破坏结构，在玻璃化生物样品中映射核心损失信号被认为不可能。直接电子探测器的出现极大提高了探测量子效率（detective quantum efficiency, DQE），将弱核心损失信号的灵敏度提升数个数量级，从而在低温保存的严格剂量限制下实现了复杂天然细胞结构的3D元素映射。更广泛地，低剂量单色器EELS、关联叠层衍射成像以及在束敏感材料或软物质系统中的应用，进一步展示了低温光谱成像的快速扩展。尽管探测器技术进步改善了剂量约束下的信号恢复，但仍需补充实验策略，如优化扫描轨迹以减轻束诱导充电，以及采用低温FIB减薄制备电子透明薄片。此外，整合飞行时间二次离子质谱（time-of-flight secondary ion mass spectrometry, ToF-SIMS）的FIB平台可实现互补的关联化学映射。

**Outlook: emerging directions for spectroscopic cryo-EM**
低温保存、先进扫描成像和低剂量光谱学的融合正将cryo-EM从主要结构技术转变为化学信息成像平台。基于上述原理验证进展，下一阶段发展需将这些能力转化为更可扩展、更具靶向性和信息更丰富的工作流程，以处理复杂生物标本。硬件持续改进对拓宽光谱cryo-EM在严格低剂量条件下的适用性至关重要。对于EDS，更大立体角的探测器几何设计将特别有价值，因为各向同性X射线发射限制了传统探测器构型的信号收集，增加每个剂量和驻留时间的检测光子数可加快采集速度并更可靠地提取化学信息。对于EELS，探测器速度和灵敏度解决互补瓶颈：更快的探测器通过减少采集大数据集所需时间提高STEM-EELS实用性；更灵敏的探测器则对在剂量约束下提取有意义信号至关重要。独特探测器设计（如空心探测器几何）可能同时收集EELS和4D-STEM衍射信号，进一步拓宽光谱cryo-EM范围。研究人员预期，在材料科学和物理学中成功的光谱成像策略将有效适配于生物系统。未来，Z衬度成像、EELS和其他关联模态的更紧密集成将实现多尺度工作流程：先识别化学差异区域，然后选择性靶向进行高分辨率分析。例如，通过cryo-FIB-SEM进行体Z衬度成像，映射细胞或组织中的元素分布，指导后续cryo-EELS和/或cryo-ET对特定感兴趣区域的分析。同时，荧光引导的cryo-FIB减薄和cryo-lift-out方法正日益实现从复杂组织中选择性分离特定细胞或亚细胞区域。这些进展将把靶向结构和化学成像扩展到更异质、更天然的环境，显著丰富从单个标本中获取的分子信息。同时，计算分析的进步可能改善从低剂量数据中恢复有用信息的能力，包括传统子采样和字典学习修补策略，以及基于深度学习的去噪、超分辨和不确定性感知图像恢复方法。近期人工智能（AI）启用的方法提示了几种高效光谱cryo-EM的潜在路线：对弱EELS信号的直接去噪、AI引导的靶向采集（将光谱学限制于选定感兴趣区域）以及结合稀疏光谱测量与低剂量采集的多模态重构框架。尽管主要在无机材料系统中开发，类似方法对光谱cryo-EM也将具有价值，尤其适用于恢复弱光谱信号、提高化学图可靠性以及将稀疏光谱数据与结构成像整合。当前，光谱cryo-EM最适用于薄、成分异质且特定元素或化学态局部富集的标本。随着仪器、多模态工作流程和计算分析的持续进步，这些方法可能日益实现对轻元素主导生物标本中细微成分差异的辨别。总体而言，这些发展将光谱cryo-EM定位为在结构生物学及更广领域中直接连接分子结构与化学组成的日益实用和强大的方法。