定量图像分析揭示达格列净在SDT脂肪大鼠糖尿病肾病模型中对肾小球硬化、足突融合和肾纤维化的益处

《European Journal of Pharmaceutical Sciences》：Quantitative Image Analysis Reveals the Benefits of Dapagliflozin on Glomerulosclerosis, Podocyte Effacement and Kidney Fibrosis in the SDT Fatty Rat Model of Diabetic Nephropathy

　　

研究人员旨在优化在自发性糖尿病Torii（SDT）脂肪大鼠（一种2型糖尿病模型）中的药物疗效研究，采用肾脏组织学图像分析包括：1）定量肾小球硬化（glomerulosclerosis）和肾小管损伤（tubular impairments）（Nephropath AI），2）足细胞精确形态测量程序（Podocyte Exact Morphology Measurement Procedure, PEMP），以及3）纤维化（fibrosis）的定量数字病理学（FibroNest平台）。为了证明这些成像方法的潜力，研究人员在喂食0.3%盐饮食并接受单侧肾切除术（unilateral nephrectomy, Unx）的SDT脂肪大鼠中评估了达格列净（dapagliflozin）治疗10周的效果。假手术（sham）的SDT脂肪大鼠和Sprague Dawley（SD）大鼠用作对照。假手术大鼠显示出更高的尿白蛋白/肌酐比值（albumin/creatinine ratio）和KIM-1水平（所有p<0.05 vs SD）。这些参数在Unx大鼠中进一步升高（所有p<0.01 vs假手术）。仅在假手术大鼠基线时观察到显著的高滤过（hyperfiltration），而Unx大鼠从基线到10周显示出显著的肾小球滤过率（GFR）下降。在假手术大鼠中，Nephropath AI显示出更多扩张/萎缩的肾小管（dilated/atrophic tubuli）和硬化肾小球（sclerotic glomeruli）（所有p<0.01 vs SD）。通过PEMP测量的滤过裂隙密度（filtration slit density, FSD）和滤过裂隙长度（filtration slit length, FSL）显著降低，表明足突融合（podocyte effacement），而FibroNest显示出表型纤维化复合评分（phenotypic fibrosis composite scores）显著增加。所有这些成像参数在Unx大鼠中显著加重。达格列净显著降低高血糖（hyperglycemia）、尿KIM-1水平并防止GFR下降。达格列净显著改善了大多数成像参数和肾脏炎症（ED1免疫染色）。定量图像分析揭示了达格列净在Unx SDT脂肪大鼠中对肾小球硬化、足突融合和肾纤维化的益处。该实验设置将有助于评估针对糖尿病肾病（diabetic nephropathy）的药物的疗效。

**论文解读：定量图像分析揭示达格列净在SDT脂肪大鼠糖尿病肾病模型中的肾脏保护作用**

**研究背景与目的**
糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是2型糖尿病（type 2 diabetes, T2D）最常见并发症，也是终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD）的主要病因。当前标准治疗基于血压控制，仅能延缓病程，尚无根治方法。钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂（sodium/glucose cotransporter 2 inhibitors, SGLT2i）如达格列净（dapagliflozin）显示出肾脏保护效应，但潜在分子机制未明。临床前研究需依赖啮齿动物模型，但现有小鼠模型仅复制DN早期阶段，缺乏晚期肾脏病变（如肾小管间质纤维化）。自发性糖尿病Torii（Spontaneously Diabetic Torii, SDT）脂肪大鼠是T2D模型，随年龄增长可发展肾小球硬化、肾小管和间质病变，但病程较长。为加速模型病程，可通过单侧肾切除术（unilateral nephrectomy, Unx）联合盐补充诱导高血压和肾功能衰退。此外，传统组织病理学评分灵敏度有限，难以精准量化药物疗效。为此，研究人员旨在通过三种先进的图像分析技术（Nephropath AI、PEMP和FibroNest），在Unx+盐补充的SDT脂肪大鼠模型中评估达格列净对肾小球硬化、足突融合（podocyte effacement）和肾纤维化的保护作用，以提高临床前药物研究的转化价值。该论文发表于《European Journal of Pharmaceutical Sciences》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用以下三种关键图像分析技术：1）Nephropath AI（Aiosyn公司）：基于人工智能的全肾组织量化工具，对PAS染色数字化切片进行分割，自动计数萎缩/扩张肾小管和硬化肾小球。2）PEMP（Nipoka公司）：基于3D结构光照明显微镜（3D-SIM），对podocin/integrin α3双染切片测量滤过裂隙密度（FSD）和滤过裂隙长度（FSL），评估足细胞足突形态。3）FibroNest（PharmaNest公司）：高分辨率单纤维图像分析平台，对天狼星红（Sirius Red）染色切片量化胶原沉积、纤维形态和组织结构，生成表型纤维化复合评分（Ph-FCS）。样本来源：雄性SDT脂肪大鼠（CLEA Japan Inc.）和Sprague Dawley大鼠（Janvier Labs, France）作为对照组。

**研究结果**
**3.1 达格列净显著降低高血糖并防止GFR下降**
通过生化检测和经皮FITC-菊粉清除率测定GFR，结果显示：假手术SDT脂肪大鼠存在明显高血糖和高滤过，Unx大鼠GFR从基线显著下降（75%减少）。达格列净治疗显著降低空腹血糖至对照水平，并部分防止GFR下降（第5周GFR升高50%，第10周升高67%，p<0.05和p<0.01）。尿KIM-1水平（肾损伤标志物）在Unx大鼠中升高，达格列净降低45%（p<0.01），但尿白蛋白/肌酐比值无显著变化。肾脏重量（绝对和相对）在Unx大鼠中增加，达格列净降低相对肾重（p<0.05）。

**3.2 达格列净对组织病理学评分影响有限**
通过PAS染色、天狼星红染色和ED1免疫组化进行半定量评分（0-4级）。结果表明：Unx大鼠%ED1染色（巨噬细胞浸润）、肾小管萎缩、管型、间质纤维化等评分均较假手术显著升高。达格列净仅显著降低%ED1染色（p<0.01），其他评分（如肾小球硬化、间质纤维化、总评分）虽呈趋势但未达统计学意义。

**3.3 Nephropath AI显示达格列净减少肾小管损伤和肾小球硬化**
Nephropath AI自动计数PAS染色切片中的病变结构。结果：Unx大鼠萎缩肾小管数量较假手术增加4倍（p<0.01），扩张肾小管数量相似。达格列净减少扩张肾小管数32%（p<0.05），萎缩肾小管减少19%（无显著）。硬化肾小球数量在Unx大鼠中较假手术增加6倍（p<0.0001），达格列净减少43%（p<0.001）。

**3.4 PEMP揭示达格列净改善足突融合**
PEMP分析podocin/integrin α3双染切片。结果：Unx大鼠滤过裂隙长度（FSL）和滤过裂隙密度（FSD）均显著低于SD大鼠和假手术，提示足突增宽/退化。达格列净显著增加FSD（p<0.05 vs Unx），FSL呈升高趋势（无显著）。肾小球平均直径在Unx大鼠中增加，达格列净呈降低趋势。

**3.5 FibroNest发现达格列净的抗纤维化作用**
FibroNest对天狼星红染色进行高分辨纤维量化。皮层区域：表型纤维化复合评分和组装纤维形态测量复合评分在Unx大鼠中显著升高，达格列净显著降低组装纤维形态测量复合评分（p<0.05）。髓质区域：趋势类似但未达显著。传统间质纤维化评分未检测到达格列净效果，而FibroNest揭示了抗纤维化效应。

**讨论与结论**
讨论部分总结：本研究建立的实验平台（Unx+0.3%盐SDT脂肪大鼠模型结合创新图像分析）为评估DN治疗药物提供了有用工具。与传统小鼠模型相比，该模型可模拟晚期肾脏病变。达格列净的降糖、防止GFR下降、降低尿KIM-1等效应与人类临床试验（DAPA-CKD）一致，但尿白蛋白/肌酐比值无显著变化，提示部分肾脏保护作用不依赖白蛋白尿减少。更重要的是，传统组织病理学评分仅检测到抗炎症作用（ED1），而Nephropath AI、PEMP和FibroNest分别揭示了达格列净在肾小管/肾小球病变、足突融合和纤维化方面的额外保护效应。这些图像分析技术已在人类肾活检中应用（如PEMP用于鉴别肾小球病），因此具有良好转化潜力。

**结论翻译**：定量图像分析揭示了达格列净在SDT脂肪大鼠糖尿病肾病模型中对肾脏病变的益处。尽管需要进一步研究充分证明成像方法的准确性，但该临床前设置将有助于证明靶向糖尿病肾病疗法的疗效，并具有良好的转化性，因为这些图像分析技术均可在动物和人类中应用。