浸润肿瘤的CD8+Ki-67+和CD8+LAG-3+T细胞与腹膜后去分化脂肪肉瘤和平滑肌肉瘤患者生存期改善相关

《Experimental and Molecular Pathology》：Tumor–infiltrating CD8+Ki-67+ and CD8+LAG-3+ T cells are associated with improved patient survival in retroperitoneal dedifferentiated liposarcomas and leiomyosarcomas

　　

肿瘤浸润免疫细胞（tumor-infiltrating immune cells）在多种癌症中塑造患者预后中发挥基础作用。腹膜后去分化脂肪肉瘤（dedifferentiated liposarcomas, DDLPS）和平滑肌肉瘤（leiomyosarcomas, LMS）与不良预后相关，因此，有必要更深入地了解这些肿瘤的免疫景观，以识别新的预后生物标志物和免疫治疗靶点。在这项探索性研究中，研究人员使用经典免疫组织化学（classical immunohistochemistry, IHC）和多重免疫组织化学（multiplex immunohistochemistry, mIHC）分析了原发性未经治疗的腹膜后DDLPS（n=22）和LMS组织（n=10）中CD8⁺T细胞（包括活化、增殖和耗竭表型）、辅助性T细胞（T helper）、巨噬细胞亚群和B细胞的空间组织、频率和比例。CD8⁺LAG-3⁺T细胞在所有分析CD8⁺亚群中占比最高。其更高密度与改善的总生存期（overall survival, OS）相关。此外，更高密度的CD8⁺Ki-67⁺T细胞与更好的OS相关，并趋于独立预测OS。有趣的是，增强的调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）密度与有利的OS相关。T细胞亚群的密度和比例在DDLPS和LMS之间无显著差异。较低密度的M2样巨噬细胞（CD68⁺CD163⁺）与更好的无进展生存期（progression-free survival, PFS）相关，并趋于作为独立预后因素。与肿瘤核心相比，侵袭边缘显示出不同的预后模式，其中高水平的CD8⁺Ki-67⁺TCF1⁺与更好的PFS相关，而升高的CD8⁺GrzB⁺和CD3⁺T-Bet⁺T细胞比例与较差的PFS相关。这些发现强调了免疫浸润在腹膜后DDLPS和LMS中的临床相关性。此外，它们支持进一步探索免疫结构以开发预后生物标志物和靶向免疫治疗策略，从而改善患者临床结局的合理性。

腹膜后去分化脂肪肉瘤（DDLPS）和平滑肌肉瘤（LMS）是两种最常见的侵袭性腹膜后软组织肉瘤（STS）亚型，其预后极差，手术为主要治疗手段，而对化疗反应率低，中位生存期仅12个月。尽管免疫疗法在多种实体瘤中显示出疗效，但在DDLPS和LMS中的应用仍有限。目前对该类肿瘤免疫微环境（TME）中特定免疫细胞亚群的预后价值认识不足，既往研究多基于异质性队列（包含不同组织学亚型和解剖部位），而专门针对腹膜后DDLPS和LMS的综合性免疫分析极为匮乏。因此，研究人员开展此探索性研究，旨在全面解析两种最常见侵袭性腹膜后STS——DDLPS和LMS的TME免疫组成，并评估其与肿瘤分级、分期及患者生存（OS和PFS）的关联，以寻找新的预后生物标志物和免疫治疗靶点。该研究发表在《Experimental and Molecular Pathology》。

研究人员使用的主要关键技术方法包括：从捷克和德国两个肉瘤中心收集32例原发性未经治疗的腹膜后DDLPS（n=22）和LMS（n=10）患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织切片；采用经典IHC检测CD20⁺ B细胞；采用两种7色多重IHC（mIHC）面板（OPAL系统）分别检测辅助性T细胞（Th）亚群（Th1、Th2、Treg）和巨噬细胞（CD68⁺CD163⁺），以及CD8⁺T细胞亚群（包括CD8⁺Ki-67⁺、CD8⁺LAG-3⁺、CD8⁺PD-1⁺、CD8⁺GrzB⁺、CD8⁺TCF-1⁺等）的密度、比例和空间分布；使用QuPath软件进行定量分析，并运用Kaplan-Meier曲线和Cox比例风险回归模型评估生存关联。

**3.1 T cell subsets, macrophages, and B cells infiltrate DDLPS and LMS**：通过mIHC和经典IHC证实，所有分析的免疫细胞亚群（包括Th1、Th2、Treg、多个CD8⁺T细胞状态、巨噬细胞和B细胞）均存在于DDLPS和LMS的TME中。巨噬细胞密度最高（472.2 cells/mm²），其中M2样巨噬细胞（CD68⁺CD163⁺）占40.7%。T细胞中Th2细胞最多（12.5 cells/mm²），其次是Tregs（3.4 cells/mm²）和Th1细胞（1.7 cells/mm²）。CD8⁺LAG-3⁺T细胞是CD8⁺亚群中比例最高的（2.4 cells/mm²）。DDLPS肿瘤中M2样巨噬细胞比例显著高于LMS，其他免疫细胞密度无组织学差异。

**3.2 Densities and proportions of tumor-infiltrating immune cells and their association with tumor grade and stage**：通过Mann-Whitney U检验分析免疫细胞与肿瘤分级（G2 vs G3）和分期（T1+T2 vs T3+T4）的关系。在整体队列中，G2肿瘤中CD3⁺T细胞和Tregs趋向更高，但未达显著性；G3肿瘤中Th1细胞比例显著升高。在DDLPS亚组中，G2肿瘤CD20⁺B细胞显著多于G3肿瘤，而G3肿瘤Th1和Th2比例更高。在LMS亚组中，分级间无显著差异，但G3肿瘤CD8⁺PD-1⁺比例趋向升高。在分期分析中，早期（T1+T2）肿瘤Th1细胞密度显著高于晚期（T3+T4）肿瘤，且Th2比例趋向升高。

**3.3 Association of tumor-infiltrating immune cell subsets and patient survival**：通过Kaplan-Meier曲线和Cox回归分析评估免疫细胞对OS和PFS的预后影响。发现更高密度的CD3⁺T细胞、CD8⁺T细胞、Tregs、CD8⁺Ki-67⁺T细胞和CD8⁺LAG-3⁺T细胞与更长的OS显著相关；CD8⁺Ki-67⁺和CD8⁺LAG-3⁺的密度和比例趋向作为OS的独立预后因素。CD8⁺PD-1⁺LAG-3⁺T细胞比例高也与延长OS相关。在PFS分析中，低密度M2样巨噬细胞显著改善PFS，并趋向独立预测PFS；而高比例CD8⁺PD-1⁺LAG-3^-T细胞与较短PFS相关。在DDLPS亚组中，高比例CD8⁺LAG-3⁺、CD8⁺PD-1⁺和CD8⁺PD-1⁺Ki-67⁺T细胞与更长的OS相关。

**3.4 Immune cells within the invasive margin and their clinical significance**：通过配对Wilcoxon检验比较肿瘤核心和侵袭边缘的免疫细胞分布。发现B细胞、CD3⁺T细胞、Th1、Th2和CD8⁺T细胞在侵袭边缘密度更高，而CD8⁺TCF-1⁺细胞在侵袭边缘密度和比例均更高。肿瘤核心具有更高比例的CD8⁺GrzB⁺、CD8⁺LAG-3⁺、CD8⁺PD-1⁺等功能亚群。在生存分析中，侵袭边缘高比例CD8⁺GrzB⁺、CD8⁺Ki-67⁺GrzB⁺和CD8⁺LAG-3⁺GrzB⁺T细胞与更短PFS相关，而高密度和高比例CD8⁺TCF-1⁺Ki-67⁺T细胞则与更长PFS相关。

讨论部分指出，本研究在较同质性的腹膜后DDLPS和LMS队列中，通过经典IHC和多重IHC勾画了免疫细胞亚群的空间分布和临床意义。发现巨噬细胞是主要免疫群体，但M2样巨噬细胞（CD68⁺CD163⁺）并未占优势（41%），仅其高密度与较短PFS相关。Th2细胞常见但无预后意义。有趣的是，高密度Tregs与更好OS相关，与部分炎症相关肿瘤中的观察一致，提示此类Tregs可能并非典型免疫抑制性细胞。在CD8⁺T细胞中，增殖性（CD8⁺Ki-67⁺）和表达LAG-3（CD8⁺LAG-3⁺）的亚群与改善生存相关，挑战了传统上将这些分子视为耗竭标志的观点，提示在这些肉瘤中它们可能反映持续的活化抗肿瘤免疫反应。侵袭边缘分析揭示了独特的预后模式：效应分子高表达细胞（如CD8⁺GrzB⁺）在边缘积聚与较短PFS相关，而干细胞样增殖细胞（CD8⁺TCF-1⁺Ki-67⁺）则与较长PFS相关，支持了T细胞招募和效应功能在肿瘤边界的差异性。研究结论翻译如下：总体而言，研究人员发现多种T细胞亚群、B细胞和巨噬细胞以不同频率存在于腹膜后DDLPS和LMS的TME中。巨噬细胞最常见，其次为T细胞和B细胞。Th1细胞在早期（T1+T2）阶段显著多于晚期（T3+T4）。在研究人员队列中，TME的免疫组成与OS和PFS相关。具体而言，更高水平的Tregs、CD8⁺LAG-3⁺和CD8⁺Ki-67⁺T细胞更常见于长OS患者。此外，在多元分析中，CD8⁺Ki-67⁺和CD8⁺PD-1⁺T细胞的较高比例趋向独立预测OS。据研究人员所知，CD8⁺Ki-67⁺的预后意义此前未在STS中描述，凸显了该发现的新颖性。M2样巨噬细胞密度与PFS相关。此外，侵袭边缘分析揭示了T细胞转运的有价值信息并显示出独立预后潜力，其中更高水平的CD8⁺Ki-67⁺TCF-1⁺T细胞与更长PFS相关，而升高比例的Th1和CD8⁺GrzB⁺T细胞亚群与更短PFS相关。这些发现可能有助于未来关于预后生物标志物的研究，并可能开启关于腹膜后DDLPS和LMS患者潜在治疗策略的讨论。