定量组织学用于成熟度分期：时机决定一切

《Fish & Shellfish Immunology》：Quantitative histology for maturity staging : Timing is everything

　　

对被开发渔业种群的精确建模首先依赖于数据质量。在每年为种群评估目的收集的生物参数中，性成熟（sexual maturity）在估计产卵种群生物量（Spawning Stock Biomass, SSB）或成熟度曲线（maturity ogive）以及鱼类种群的首次成熟体长/年龄等变量时至关重要。在本文中，研究人员采用了一种基于定量组织学（quantitative histology）的方法，用于确定来自比斯开湾（Bay of Biscay, n=103）或英吉利海峡（English Channel, n=214）种群的317尾雌性栓皮鲻（Striped red mullet, Mullus surmuletus）的性成熟阶段。研究人员不仅通过识别最先进的生殖细胞（germline cell）类型来将个体分类到某一成熟阶段，还对卵巢横切面上的细胞结构进行了定量分析。这使得研究人员能够验证性腺内的细胞同质性，实施一种可重复的读数方法用于读片员校准（细胞特征识别的差异小于3%），并最终将个体分类到成熟阶段。当使用组织学方法时，用于识别已产卵个体的细胞结构在产卵期（spawning period）后立即消失，导致在产卵期外对未成熟（Immature, A）个体的高估。这强调了在产卵期内采集样本以避免高估未成熟个体的重要性。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

在渔业管理中，准确的性成熟（sexual maturity）阶段数据是评估渔业种群动态和可持续性的基石，直接影响产卵种群生物量（Spawning Stock Biomass, SSB）、成熟度曲线（maturity ogive）以及首次成熟体长/年龄（如L₅₀或A₅₀）等关键参数的估计。传统宏观方法（macroscopic method）虽简便快捷，但依赖于肉眼观察性腺外观，容易产生主观偏差，尤其在识别特定物种的成熟标准时不确定性较大。组织学（histology）方法被公认为最准确，但其依赖读片员对最先进生殖细胞（germline cell）类型和结构（如排卵后滤泡Post-Ovulatory Follicle, POF）的鉴别，既耗时又资源密集，且同样存在读片员间的偏差。此外，在非产卵期（spawning period），如POF和晚期卵母细胞等标志结构会迅速消失，可能导致已产卵个体被误判为未成熟。针对这些局限，研究人员开展本研究，旨在通过定量组织学（立体学stereology）方法客观确定雌性栓皮鲻（Mullus surmuletus）的性成熟阶段，比较与宏观方法的一致性，追踪卵巢细胞结构比例的时间动态，并解决非产卵期未成熟个体高估的问题。该论文发表在《Fish》。

**主要关键技术方法**

研究采用的主要技术方法包括：1) **样本队列来源**：317尾雌性栓皮鲻（Mullus surmuletus）来自比斯开湾（Bay of Biscay, n=103）和英吉利海峡（English Channel, n=214）两个种群，样本通过商业渔船和科学调查（如CGFS、EVHOE、IBTS）获取，采样时间覆盖2020年11月至2022年8月。2) **组织学处理**：卵巢横切片经固定、脱水、石蜡包埋、切片（3μm）和三色染色。3) **立体学定量**：基于Glagolev法，使用QuPath软件对数字化切片叠加500-600个等距网格点，计数18种卵巢细胞结构（包括卵原细胞、各阶段卵母细胞、排卵后滤泡POF、闭锁卵母细胞α/β等）的命中点数，计算体积分数（area fraction）。4) **读片员校准**：通过细胞同质性测试和读片员间校准（差异<3%），确保重复性。5) **层次聚类**：对立体学归为未成熟（A）的216个个体，基于主要细胞特征百分比进行无监督学习，区分真正未成熟（A0）和潜在未来发育（pfB）个体。6) **成熟阶段判定**：根据体积分数阈值自动分类成熟阶段（A、B、Ca、Cb、E），其余归为D。

**研究结果**

**3.1 立体学结果**
**3.1.1 比斯开湾种群**：通过计算103尾雌性M. surmuletus的月平均生殖细胞百分比（图3）发现，产卵期（5月-7月）以卵黄生成期卵母细胞（vtg）和硬化期卵母细胞（ho）为主，POF出现率低（1%）；产卵后（9月）脂滴期卵母细胞（ldo）比例高（61%），闭锁卵母细胞α（aoA）在7月达14%。此项研究阐明了细胞结构随时间的变化模式。
**3.1.2 英吉利海峡种群**：对214尾个体的分析（图4）显示，皮质肺泡期卵母细胞（cao）在2月-4月上升至74%，5月vtg达47%；POF仅在5月出现（<1%）；产卵后（8月）ldo超过50%。研究表明该种群产卵期始于3月（卵黄生成），5月出现产卵个体。
**3.1.3 卵母细胞发生的时间动态**：按月份和体长分类的成熟阶段（图5）表明，两个种群在产卵期间（5月-7月）出现大量产卵期个体（Ca/Cb），但非产卵期（8月-12月）140尾中136尾被归为A，其中包括体长>24 cm的潜在成熟个体。此结果揭示了产卵后结构消失导致误分类的现象。
**3.2 宏观方法与立体学方法的成熟阶段比较**：混淆矩阵（表4）显示，宏观方法归为未成熟（A）的57尾个体中，立体学确认93%正确，但7%实际处于发育期（B）；宏观法归为B的个体中，66%被立体学重新归为A。立体学归为A的个体占总数68%（216/317）。该比较凸显了宏观方法对未成熟个体的低估和对发育期个体的高估。
**3.3 产卵期外的成熟分期**：对216个立体学归为A的个体进行层次聚类，分为真正未成熟（A0）和潜在未来发育（pfB）两组（图6），pfB个体在产卵前后出现，且体长较大（普遍≥21 cm）。主要区分变量为ldo的存在（图7），ldo被认为是未来产卵季节的储备卵母细胞。此项研究提供了区分真正未成熟与潜在成熟个体的方法。
**3.4 首次成熟体长**：计算两种方法下的L₅₀（表5）。宏观方法对比斯开湾和英吉利海峡种群的L₅₀估计值分别为16.1 cm和18.7 cm；立体学方法（包括pfB）分别为20.1 cm和24.7 cm；排除pfB后分别为23.1 cm和25.8 cm。结果表明，立体学方法由于高估未成熟个体导致L₅₀升高，且是否纳入pfB对估计值影响显著。

**讨论与结论**

**讨论部分总结**：研究人员指出，M. surmuletus的产卵期在比斯开湾为5-7月，英吉利海峡为5月（峰值6月），但采样机会性限制了完整追踪。立体学方法中，POF和晚期卵母细胞在产卵后迅速消失，导致大量已产卵个体被误分为未成熟（A），尤其在高体长个体中。而宏观方法则因卵巢早期血管化而将未成熟个体错判为成熟，使L₅₀偏低。为解决误分类，通过层次聚类识别了pfB个体（含ldo），提示其可能为未来产卵者，但现有数据无法区分已产卵与未产卵个体。两种方法均强调在产卵期（3-8月对立体学，5-7月对宏观方法）内进行定期采样（每月或双月）并涵盖多体长类别的重要性。种群状况方面，这两条M. surmuletus种群在ICES数据分类中均为第5类（仅上岸数据），缺乏总允许捕捞量（Total Allowable Catch, TAC）和最小上岸体长，且出现过渔迹象。

**结论部分翻译**：当研究目的是为某个物种建立成熟度曲线时，所需数据仅为个体是否未成熟或性成熟。首要步骤是识别未成熟（A）个体与进入性成熟状态（B、C、D）个体的差异。准确识别这一过渡时期及其对应的生物学参数（年龄、体长、性腺外观、生殖细胞），将确保获取精确数据。然而，当这些差异在两个产卵期之间消失时，必须解决该问题，并在数据用于种群评估时采取预防措施。上述方法并非新颖，早已被确立为可靠且可转移至所有鱼类物种，但应根据繁殖特性进行微调。在渔业管理中，对被开发种群物种性成熟阶段的准确评估可确保首次性成熟年龄和体长的合理估计，从而更精确地估算产卵种群生物量（SSB），这是定义总允许捕捞量（TAC）和最小法定体长（Minimum Legal Length, MLL）的重要指标，最终有利于种群的可持续利用。本研究中，研究人员通过组织学和立体学确定M. surmuletus的L₅₀，通过实施标准化方案确保了客观性和重复性，并通过读片员校准保证了可复现性。细胞同质性测试证实，卵巢任何部位采样的横切片均可得到相同读数。最后，无论使用宏观方法还是立体学方法确定成熟阶段，为减少误分类风险，在产卵期（对M. surmuletus而言：立体学为3-8月，宏观方法为5-7月）推进每月或双月采样并考虑多体长类别至关重要。作为结语，可以争论说，由于时间和资源成本过高，所提出的组织学和立体学方法难以在科学调查中应用于所有商业物种。然而，定量组织学无疑是获取准确成熟度数据的必备方法，或至少是其他方法（如整体封片法）的补充工具。一种减轻工作量的方式是，在物种基准评估前一年，定期实施组织学研究以更新成熟度曲线，而在其他时段则可通过宏观方法常规采集数据。此外，可训练深度学习算法（AI）辅助立体学切片读数，虽不能完全取代人工读片员，但无疑能缩短读数时间。