单细胞转录组分析揭示了T淋巴细胞的微环境，并确定HOPX为膜性肾病的核心基因

《Gene》：Single-cell transcriptomic analysis reveals the T lymphocyte microenvironment and identifies HOPX as a hub gene in membranous nephropathy

　　

姚利|王瑶瑶|侯彦娇|郑庆|张伟|杨贤聪

中国山东省青岛市266011，青岛大学附属医院心血管内科

摘要

背景

膜性肾病是一种自身免疫性疾病，其特征为免疫复合物沉积以及肾功能逐渐受损。尽管已有研究表明，适应性免疫功能的紊乱，尤其是T淋巴细胞的异常，在该病的发病机制中起着重要作用，但针对膜性肾病病理过程中免疫细胞亚群及关键免疫反应基因的研究仍不完善。

方法

本研究结合了GSE193512中的单细胞RNA测序数据与GSE142025中的批量RNA测序数据。通过差异表达分析、高维加权基因共表达网络分析、伪时间轨迹推断以及细胞间通讯分析，系统研究了免疫细胞微环境的构成及基因调控变化。同时，运用四种机器学习算法共同筛选核心基因。我们收集了53例膜性肾病患者和健康对照组的临床血液样本，并通过qRT-PCR和流式细胞术进行实验验证。

结果

研究结果显示，PLA2R阳性的患者外周血中CD8阳性T细胞和自然杀伤细胞数量显著增多，且在非缓解期的膜性肾病病例中，这些细胞的功能状态出现明显改变。在单细胞RNA测序数据中，通过高维加权基因共表达网络分析及四种机器学习算法的联合筛选，确定了T细胞内的10个关键模块基因，包括GNLY、NKG7、GZMB、KLRD1、HOPX和ZEB2。多种算法的综合分析一致表明HOPX是核心核心基因。膜性肾病患者外周血中的HOPX表达显著升高，qRT-PCR和ROC曲线分析也证实了其诊断价值。细胞间通讯分析显示，T细胞和NK细胞通过MIF和GZMA等信号通路形成活跃的相互作用网络，表明这些通路在免疫反应中起关键作用。

结论

总之，本研究通过高分辨率的单细胞测序技术揭示了膜性肾病的免疫细胞特征，并首次将HOPX确定为潜在的新型诊断生物标志物。研究阐明了淋巴细胞功能异常、代谢重塑和免疫耗竭在疾病进展中的重要作用。这些发现不仅加深了对膜性肾病免疫病理机制的理解，还为开发针对性的免疫治疗策略提供了重要的理论依据和候选靶点。

引言

膜性肾病是一种自身免疫性肾脏疾病，其特征为免疫复合物沉积在肾小球基底膜的上皮下侧，通常表现为大量蛋白尿和肾功能逐渐恶化（Bansal和Chonchol，2025）。作为成人肾病综合征最常见的原发性病因之一，膜性肾病的复发率很高，部分患者最终会发展为终末期肾病，临床预后较差（Knol等人，2024；Boletta和Caplan，2025）。目前的治疗主要依靠非特异性免疫抑制剂，虽能在一定程度上控制病情，但不同患者的疗效差异较大，且常常伴有严重副作用。要治愈这种疾病，就需要开发更精准、更安全的疗法（Lichtnekert和Anders，2024）。

膜性肾病的发病机制与适应性免疫系统的异常激活密切相关，尤其是T淋巴细胞的功能失调起着核心作用。T细胞不仅协助B细胞活化、分化，并产生针对足细胞抗原如PLA2R和THSD7A的致病性自身抗体，还是调节体液免疫反应的关键介质（Claudel和Verma，2025；Byun，2025）。PLA2R和THSD7A是原发性膜性肾病中两种主要的靶抗原，分别占病例数的约70%和1%~5%。它们的发现彻底改变了膜性肾病的诊断和治疗方式，针对这些足细胞抗原的自身抗体现已被确认为免疫复合物沉积的主要驱动因素。此外，特定的T细胞亚群，如细胞毒性CD8+ T细胞以及Th1、Th2、Th17等多种辅助T细胞，也可能直接参与局部的肾小球炎症和足细胞损伤（Hong等人，2025）。然而，膜性肾病中这些T细胞群体的表型多样性、功能状态以及背后的分子调控网络尚不清楚，这限制了人们对疾病免疫机制的深入理解。

近期研究表明，T细胞功能异常和免疫耗竭在自身免疫性疾病的慢性化进程中起着重要作用（Kotwal和Perkovic，2024）。在膜性肾病的背景下，持续的自身抗原刺激和免疫调节失衡可能导致T细胞处于持续活化状态或出现免疫耗竭表型，表现为抑制性受体表达升高、效应功能减弱以及细胞因子分泌异常（Li，2024；Muto，2024；Rabelink等人，2024）。这类功能异常的T细胞可能打破免疫耐受，引发慢性炎症，进而加重肾组织损伤。虽然批量RNA测序技术已初步揭示了膜性肾病整体免疫微环境的变化，但其局限性在于无法解析高度异质性的T细胞群体的内部结构（Seibt，2024）。单细胞RNA测序技术则可以有效克服这一局限，能够以单细胞分辨率精确分析不同T细胞亚群的转录特征，识别稀有细胞类型、过渡状态及特定信号通路，从而极大提升我们对免疫调节机制的理解（Subramanian，2024）。将单细胞RNA测序数据与批量RNA测序数据相结合，可以更好地将细胞组成变化与整体基因表达模式联系起来，更准确地判断各类细胞群体对疾病表型的影响（Avasare等人，2025）。

本研究旨在通过整合单细胞RNA测序和批量RNA测序数据，系统分析膜性肾病患者T淋巴细胞的免疫特征。我们希望识别出新的T细胞亚群，确定其差异表达基因，并探索与疾病发展相关的关键免疫通路（Bavanandan等人，2025；Cai，2025）。同时，还将运用先进的生物信息学算法筛选潜在的核心驱动基因，并在独立的临床样本中验证其表达水平（Grahammer，2024）。这项研究明确了膜性肾病中T细胞的异质性及其亚群特征，不仅深化了对该病免疫病理机制的理解，也为未来寻找可靠的生物标志物和精准的治疗靶点提供了理论依据和数据支持（Hu，2024；Imai，2025）。

章节节选

数据收集

单细胞RNA测序（GSE193512）数据和批量RNA测序（GSE142025）数据来自基因表达组数据库（GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。在单细胞RNA测序数据中，样本GSM5811751_NR和GSM8641664_NR对应非缓解期患者，而GSM5811750_CR对应完全缓解期患者。此外，GSE142025数据集还包含了28例膜性肾病患者和9名健康对照者的批量RNA测序数据。

单细胞RNA测序数据分析与细胞注释

利用单细胞RNA测序数据解析膜性肾病的免疫特征

本研究的技术流程如图1所示。我们从GEO数据库中获取了三个样本的单细胞转录组数据，用于分析膜性肾病的细胞异质性（图2A）。通过比较膜性肾病患者与健康对照组的单细胞RNA测序数据，共识别出2000个高变基因。随后采用主成分分析进行维度降维，最终得到了17个不同的细胞簇。基于人工注释

讨论

这项综合转录组学研究高分辨率地分析了膜性肾病的免疫特征，尤其关注了T淋巴细胞的异质性及功能异常情况（Kolligundla，2025）。研究结果强烈表明，非缓解期并非单纯的临床表型，而是与肾微环境中持续且紊乱的免疫活化状态密切相关，这种状态主要由特定的T细胞和NK细胞驱动

资金支持声明

本研究得到了山东省自然科学基金（ZR2024QH262，ZR2024QH640）的支持，以及青岛大学附属医院青年科研基金（QDFYQN2023111，QDFYQN2023119）的资助。

CRediT作者贡献声明

姚利：概念设计。王瑶瑶：数据整理。侯彦娇：概念设计。郑庆：概念设计。张伟：资金筹集。杨贤聪：论文撰写——审稿与编辑，论文撰写——初稿撰写。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

无。

数据与材料提供情况

本研究中使用和分析的所有数据集，可在合理请求下从相应作者处获取。

伦理审批声明

本研究方案已获得烟台市玉皇顶医院伦理审查委员会的批准（批准编号：2025-776）。所有涉及人类受试者的研究程序均符合该机构的伦理标准。在受试者入组前，均已获得其书面知情同意。

作者贡献

杨贤聪