《Gene》：A genetic linkage map based on Genotyping-By-Sequencing SNPs for giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii (De Man, 1879) and comparative genome analysis
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斯维克鲁蒂·索纳利·卡尔|斯提塔普兰吉亚·钱德|P.达斯|宾杜·R.皮莱|德巴布拉塔·潘达|普拉比娜·K.梅赫尔|普里扬卡·C.南丹帕瓦尔|萨纳坦·马吉|L.萨胡印度奥里萨邦布巴内斯瓦尔751002，ICAR-淡水水产养殖中央研究所摘要巨型淡水对虾Macrobrachium ro
斯维克鲁蒂·索纳利·卡尔|斯提塔普兰吉亚·钱德|P.达斯|宾杜·R.皮莱|德巴布拉塔·潘达|普拉比娜·K.梅赫尔|普里扬卡·C.南丹帕瓦尔|萨纳坦·马吉|L.萨胡
印度奥里萨邦布巴内斯瓦尔751002，ICAR-淡水水产养殖中央研究所
摘要
巨型淡水对虾Macrobrachium rosenbergii是一种具有重要商业价值的水产养殖物种，人们正在通过选择性育种来提升其生长性能。尽管最近已经获得了染色体级别的参考基因组，但该物种仍缺乏基于SNP的密集连锁图谱。在这里，我们首次利用基因分型测序（GBS）技术，为M. rosenbergii构建了基于单核苷酸多态性（SNP）标记的连锁图谱。计算机模拟限制性酶分析表明，EcoRI-MseI组合最适合用于Illumina测序，且能有效降低基因组复杂性。通过对147个个体（包括亲本）进行GBS测序，每个样本产生了大约3.6 Gb的序列数据，共获得61,417个高质量SNP标记。这些标记经过进一步筛选，去除了缺失基因型（≤30%）、符合哈代-温伯格平衡（p ≤ 0.05）、等位基因频率过低（MAF ≥ 0.05）、分离畸变、相同基因型以及重复标记，最终得到了5,317个可用于后续分析的有效SNP标记。使用OneMap在LOD值为6的情况下进行连锁分析，成功将2,723个标记映射到59个连锁群中，这些连锁群对应于单倍体染色体数目，总长度为5,576.48 cM，平均标记间隔为2.18 cM。各个连锁群的平均长度为94.52 cM。将这些连锁群与染色体级别的组装基因组进行同线性分析，发现两者之间存在一一对应关系；而M. rosenbergii与M. nipponense的比较基因组分析则揭示了二者在染色体同线性方面的相似性以及大量的结构重排，这些既体现了它们共有的基因组特征，也反映了各自独特的进化路径。这一基于SNP的M. rosenbergii连锁图谱代表了甲壳类动物基因组学领域的重大进展，也为未来该重要商业物种的遗传改良和育种工作提供了宝贵的基因组资源。
引言
水产养殖是全球增长最快的食品生产领域之一，对全球粮食安全、经济发展以及就业机会有着重要贡献。2022年全球渔业和水产养殖产量达到了2.232亿吨，较2020年增长了4.4%（FAO，2024），这一数字创下了历史新高。印度的水产养殖主要以本地鲤鱼为主，同时也会养殖多种甲壳类动物，比如咸水虾、淡水对虾以及淡水和咸水蟹（Sahoo等人，2023）。在这些物种中，巨型淡水对虾Macrobrachium rosenbergii——通常被称为淡水“龙虾”或巨型河虾、马来西亚对虾，原产于泰国及其他几个东南亚国家，是印度水产养殖中的重要物种（Pillai等人，2022）。
十足目虾类是全球最具经济价值的甲壳类动物之一，但由于其基因组规模较大且重复序列较多，长期以来一直难以完成完整的基因组测序和组装（Yuan等人，2016）。在Pancrustacea分支内的系统基因组学分析表明，十足目虾类与其他甲壳类动物，如Daphnia pulex，在基因家族组成上存在显著差异，虾类的基因家族在与离子结合、过氧化物酶活性以及细胞骨架结构相关的功能上有所扩展，而这些特性都与其在海洋环境中的适应能力有关（Yuan等人，2021）。尽管有了基于转录组的关于虾类基因组进化的研究成果，但对于像Macrobrachium这类具有重要经济价值的属来说，了解其结构基因组架构和同线性保守性的染色体级比较框架仍然几乎未被探索。
M. rosenbergii广泛分布于印度的河流系统中，其产量从20世纪90年代中期的不到500吨增长到2005年的42,000多吨（Pillai等人，2020）。然而，从2006年到2012年，由于生长速度慢以及养殖过程中的存活率低，其在印度的产量出现下降，从而导致经济效益不佳。研究发现，近亲繁殖导致的衰退是其中一个重要原因，因为养殖场主往往不进行适当的基因管理，反复使用养殖池中的亲本虾（Pillai等人，2020）。为了解决这些问题，2007年，印度布巴内斯瓦尔的ICAR-淡水水产养殖中央研究所与马来西亚的WorldFish机构合作，启动了一项选择性育种计划，旨在提升该物种的生长性能和生产力。该计划每代平均能带来4%到7%的遗传增益，显著提升了M. rosenbergii的生长速度、存活率和产量。经过努力，2020年终于培育出了一个经过遗传改良的品系，并将其注册为“CIFA-GI Scampi?”品牌（Pillai和Panda，2024）。
在十足目甲壳类动物中，M. rosenbergii在细胞遗传学上具有独特性，其典型的二倍体染色体数目为2n = 118（n = 59）（Pootakham等人，2024）。它的核型包含中着丝粒染色体、亚中着丝粒染色体、亚端着丝粒染色体和端着丝粒染色体，不同研究报告中给出的染色体数目存在差异，这可能是由于分类标准以及染色体形态的不同所致（Molina等人，2020）。这些染色体的尺寸通常较小，其中最小的染色体对长度还不到1.0微米（Molina等人，2020）。值得注意的是，这种对虾没有性别染色体异形性的现象，而且其基因组中含有大量重复序列，尤其是分布在染色体臂上的简单序列重复序列（Molina等人，2020）。
最近，人们获得了M. rosenbergii的高质量染色体级别参考基因组，其完整性高达94.5%，组装后的基因组大小、支架N50值以及连续片段N50值分别为3.18 Gb、62.73 Mb和8.92 Mb（Zheng等人，2024）。值得一提的是，已组装的基因组中有98.6%都对应到59条染色体上。该基因组中重复序列占比为43.77%，同时还鉴定出了17,436个蛋白质编码基因（Zheng等人，2024）。这一完备的基因组资源为该物种的遗传改良以及十足目甲壳类动物的比较基因组研究奠定了坚实基础。尽管已经有了染色体级别的基因组组装结果（Zheng等人，2024），但针对M. rosenbergii的基因组资源仍然缺乏全基因组标记面板、连锁图谱、QTL研究以及群体基因组资源。填补这些空白对于加速该物种的遗传改良进程以及推动其水产养殖业的可持续发展至关重要。
下一代测序（NGS）技术的最新发展使得在大型且复杂的基因组中检测高密度的分子标记成为可能，尤其是单核苷酸多态性（SNPs）的检测。基因分型测序（GBS）是一种成本效益较高的NGS技术，它通过限制性酶消化的方式来简化复杂基因组的表示形式，因此非常适合用于分析那些基因组规模较大、具有多倍体结构或基因组资源有限的物种（Narum等人，2013）。这种方法已被广泛应用于包括水生生物在内的各种动物研究中，用于生成高密度的SNP数据集，从而便于开展遗传多样性分析、关联研究以及构建密集的连锁图谱（Narum等人，2013）。由于一次实验就能生成数千个标记，GBS成为了构建高分辨率连锁图谱的强大工具，而这些连锁图谱则是定位数量性状基因座（QTL）以及阐明生长、生存能力、性别决定等关键性状的遗传基础的重要依据。这些工具不仅有助于解析各种性状，还能通过标记辅助选择和基因组选择来培育出更优良的品种，进而提高水产养殖的生产效率（Sukumaran，2023）。此外，连锁图谱还能通过提供独立的支架结构并识别出结构上的错误组装，来帮助验证和优化基因组组装结果（Verde等人，2017）。鉴于M. rosenbergii的经济重要性以及目前其在基因组资源方面的不足，本研究采用了GBS技术，结合标准的SNP检测流程和连锁分析方法，为这一重要的水产养殖物种构建了首个基于SNP的连锁图谱。
章节节选
绘图群体的世代选择与采样
用于构建连锁图谱的群体来源于印度布巴内斯瓦尔ICAR-淡水水产养殖中央研究所正在开展的第16代选择性育种计划。研究人员挑选了5只雌性和4只雄性亲本虾，通过5种不同的配对方式进行交配，从而形成了5个绘图群体（见图1）。在采集附肢组织样本之前，研究人员首先对所有亲本虾的形态参数进行了测量，包括体长（毫米）、体重（克）、甲壳长度（毫米）等等。
计算机模拟限制性酶性能评估
对限制性酶性能的计算机模拟分析对于优化GBS实验方案至关重要。在单一酶消化实验中，MseI产生的片段数量最多，达到了17,547,650个，而PstI产生的片段数量最少，仅为75,110个；EcoRI和ApeKI产生的片段大小分布处于中间水平，分别有116,213个和99,993个片段。大小分布分析显示，MseI产生的片段大小范围最小，集中在1–50碱基对之间，共有8,186,345个此类片段，而EcoRI产生的片段则
讨论
遗传连锁图谱是解析定性性状和定量性状遗传基础的重要工具，对于现代选择性育种计划而言不可或缺。随着NGS技术的进步，像GBS这样的技术已成为生成大量单核苷酸多态性（SNPs）标记的首选方法，而这些标记正是构建高分辨率连锁图谱所必需的（Lu等人，2015）。
GBS技术的效率取决于对限制性酶的精心优化，只有这样才能实现最佳的基因组复杂性降低效果，并最大限度地
结论
在本研究中，我们首次利用GBS技术为M. rosenbergii构建了基于SNP的连锁图谱。该图谱不仅显示与该物种59条染色体之间存在一一对应关系，而且在优化基因组组装方面也发挥了实际作用，它为先前未能定位的基因组支架提供了参照依据，从而为未来的遗传学、基因组学以及水产养殖相关研究奠定了重要基础。通过对M. rosenbergii和的比较基因组分析，可以发现二者在染色体结构上存在保守性
CRediT作者贡献说明
斯维克鲁蒂·索纳利·卡尔：负责原文撰写——初稿、方法部分、正式分析。斯提塔普兰吉亚·钱德：负责原文撰写——审阅与编辑、方法部分。P.达斯：负责原文撰写——审阅与编辑、项目管理工作。宾杜·R.皮莱：负责原文撰写——审阅与编辑、资源筹备、项目管理工作。德巴布拉塔·潘达：负责原文撰写——审阅与编辑、资源筹备、项目管理工作。普拉比娜·K.梅赫尔：负责项目管理工作、正式分析、数据整理工作。普里扬卡·C.南丹帕瓦尔：负责原文撰写——审阅与编辑、项目
资金支持
本研究的资金支持来自印度农业研究委员会（ICAR）旗下的国家农业科学基金（NASF），以及印度政府的农业研究与教育部门。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
致谢
本研究的资金支持同样来自印度农业研究委员会（ICAR）旗下的国家农业科学基金（NASF）、印度农业研究委员会（ICAR）以及印度政府的农业研究与教育部门。作者们还要感谢ICAR-淡水水产养殖中央研究所的所长，感谢他为研究提供了实验室设施。此外，作者们还要感谢Bionivid Technology Pvt. Ltd.公司为研究提供的测序服务以及在数据分析方面给予的帮助。
