《Gene》：Identification and pathogenicity validation of a novel MLH1 frameshift mutation in Lynch syndrome pedigree
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林奇综合征（Lynch syndrome，LS）是最常见的遗传性结直肠癌（colorectal cancer，CRC）综合征，约占所有CRC病例的2%–3%，并显著增加受累家族成员的癌症风险，有必要采取针对性的预防干预措施。本研究对一名2020年10月在昆明医
林奇综合征（Lynch syndrome，LS）是最常见的遗传性结直肠癌（colorectal cancer，CRC）综合征，约占所有CRC病例的2%–3%，并显著增加受累家族成员的癌症风险，有必要采取针对性的预防干预措施。本研究对一名2020年10月在昆明医科大学第一附属医院诊断为结肠癌、符合Amsterdam II标准的40岁女性先证者进行了检查。该四代家系共包含42名成员，其中9人患有恶性肿瘤，平均发病年龄为44.3岁，符合经典LS家系特征。在收集血样、临床数据和构建家系后，对先证者进行下一代测序（next-generation sequencing，NGS），发现MLH1外显子6中存在一个新的胚系移码突变：c.463dupC（p.L155Pfs*17）。随后对20名一级亲属进行Sanger测序，在7名携带者中确认了该变异，包括3名确诊结肠癌的个体，表明该突变与疾病表型完全共分离。
**论文解读：林奇综合征家系中MLH1新发移码突变的鉴定与致病性验证**
**1. 研究背景、存在问题与目的**
林奇综合征（Lynch syndrome，LS）是发病率最高的遗传性结直肠癌（colorectal cancer，CRC）综合征，约占所有新诊断CRC病例的2%–3%。其发病机制与错配修复（mismatch repair，MMR）基因（MLH1、MSH2、PMS2、MSH6）及EPCAM基因的胚系致病突变密切相关。当携带MMR基因胚系突变的个体发生野生型等位基因的体细胞丢失时，会导致MMR蛋白表达异常，造成错配修复功能缺陷（mismatch repair deficiency，dMMR），进而引发微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）这一分子表型，成为遗传性CRC相关肿瘤发生与进展的关键机制。LS患者面临显著升高的终生CRC发病风险，且发病年龄较早，同时罹患子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌等多种肠外肿瘤的风险也增加。LS相关CRC的腺瘤-癌序列进展更快（约35±23个月），远短于散发性CRC的10年进展时间。
目前LS的临床诊断遵循“分层筛查-验证-确诊”流程：先评估患者个人及家族史是否符合Amsterdam II标准、改良Bethesda标准或中国LS诊断标准；随后通过肿瘤免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）和MSI检测评估MMR状态；若IHC显示MLH1表达缺失或MSI检测为高度微卫星不稳定性（MSI-H），需进一步检测BRAF V600E突变以排除由MLH1启动子高甲基化引起的散发性CRC。最终确诊依赖于基因检测，检测到具有临床意义（致病性或可能致病性）的MMR基因胚系突变方能确诊。然而，大多数已鉴定的变异为错义突变，其中相当一部分的临床意义尚未确认，被归类为意义不明确的变异（variants of uncertain significance，VUS）或未分类变异（unclassified variants，UV）。确定这些变异的致病性是对携带者及其家庭实施靶向癌症监测策略的前提。国际胃肠遗传性肿瘤学会（InSiGHT）制定的MMR基因变异分类标准采用多因素方法将变异分为5类。基于此背景，本研究聚焦于一个临床表现符合LS诊断标准的CRC先证者，旨在通过NGS鉴定MMR基因中的新发突变，并系统验证其致病性，为家系成员提供个性化治疗和标准化健康管理方案，为LS的临床诊断和高危人群管理提供实践参考。
**研究人员开展了什么研究、得出什么结论、有什么重要意义**
研究人员对一个中国南方四代LS家系（共42名成员，9人患恶性肿瘤，平均发病年龄44.3岁）的先证者进行NGS分析，鉴定出一个新的MLH1胚系移码突变c.463dupC（p.L155Pfs*17）。通过Sanger测序对20名一级亲属进行验证，确认7名携带者（包括3名确诊结肠癌患者），证明该突变与疾病表型完全共分离。对先证者肿瘤组织进行IHC和MSI检测，结果显示MLH1和PMS2表达缺失，MSI-H（58.82%的位点发生改变）。体外表达分析显示，该突变导致全长MLH1蛋白完全缺失。生物信息学分析表明，该截短突变破坏了MLH1的N端ATP酶结构域及多个关键功能区域（如MSH2结合基序、EXO1相互作用域、核定位信号、与PMS2二聚化的C端结构域）。根据InSiGHT分类标准，该MLH1 c.463dupC被归类为致病性变异。研究证实该突变为该家系LS的遗传病因，并依此对携带者实施标准化风险管理，取得了初步成效。论文发表在《Gene》。
**2. 主要关键技术方法**
本研究主要关键技术方法包括：1）对先证者外周血DNA进行NGS（使用元世博?Panel，涵盖87个基因包括MMR相关基因），采用杂交捕获法富集靶基因全外显子区域，在Illumina测序平台进行150bp双端测序，平均测序深度≥100×，利用GATK/SAMtools进行变异检出，CoNIFER算法评估拷贝数变异；2）对20名家系成员外周血进行Sanger测序验证，针对MLH1外显子18设计引物（F: TCTTATCCCTGGCCCCAGTC; R: GCTGCACACACTTCATGTGG）；3）对先证者肿瘤组织进行MSI检测（云影NGS-Panel39+MSI检测，评估17个指定位点）；4）构建pcDNA3.1-MLH1野生型及变异重组质粒（包括MLH1 c.463dupC、致病对照c.2041G>A、良性对照c.2146G>A），在HEK-293T细胞中进行瞬时转染，通过Western blot检测MLH1蛋白表达水平；5）生物信息学分析：使用AlphaFold2生成MLH1-PMS2异源二聚体全长模型，PyMOL软件可视化。样本队列来源：中国南方的一个四代LS家系，先证者来自昆明医科大学第一附属医院。
**3. 研究结果**
**3.1 临床发现**
先证者（III-10）为46岁女性，40岁时诊断为结肠癌。家系共42名成员，8人患有与常染色体显性遗传LS相关的癌症（平均年龄44.3岁）。具体包括：个体I-1（48岁）、II-1（70岁）、III-2（40岁）死于CRC；先证者III-10（40岁确诊）；III-21（30岁确诊结肠癌）；II-3（42岁）、II-7（42岁）、II-9（48岁）死于肝脏恶性肿瘤（病史记录有限，不排除CRC肝转移）；III-19在后续检测中发现31岁患结肠癌。通过Amsterdam II标准确诊LS。
**3.2 NGS分析鉴定出一个新的MLH1移码突变c.463dupC**
对先证者进行NGS，初步筛选出30个与遗传性癌症综合征相关基因的45个变异。经严格过滤（等位基因频率MAF<0.01），精确定位到MMR基因MLH1（NM_000249.3）外显子6的一个新发移码突变c.463dupC（p.L155Pfs*17），位于chr3:37050314（GRCh37/hg19）。该变异在所有群体数据库中均不存在，预测导致MLH1蛋白从第155位氨基酸开始移码，17个残基后出现提前终止密码子。同时，使用CoNIFER算法对MMR基因和EPCAM进行大片段重排和拷贝数变异系统分析，未发现致病性结构变异，确认该SNV为孤立病变。
**3.3 Sanger测序显示MLH1 c.463dupC变异与疾病在家系中共分离**
对20名家系成员（包括先证者）进行MLH1基因Sanger测序，发现7名个体（III:4、III:8、III:10、III:19、III:20、III:21、IV:1）携带该变异。其中：先证者III:10（40岁左半结肠腺癌，0/22淋巴结转移）；III:21（30岁左半结肠腺癌，0/7淋巴结转移）；III:19（31岁结肠腺癌，0/18淋巴结转移）；其余4名携带者至今未发生肿瘤。该变异在3名患结肠癌的携带者中与疾病共分离。
**3.4 先证者肿瘤组织中MLH1和PMS2表达缺失**
先证者肿瘤组织HE染色显示恶性细胞特征和异常增殖。IHC分析显示MLH1（-）和PMS2（-）表达缺失，而MSH2（+）和MSH6（+）表达保留。MSI检测显示17个检测位点中有10个发生改变（58.82%），归类为MSI-H。IHC和MSI结果一致提示DNA错配修复缺陷（dMMR）通路，MLH1/PMS2蛋白复合物特异性缺失与MSI-H状态共同证明胚系MLH1 c.463dupC突变与肿瘤组织中MMR蛋白功能受损相关。
**3.5 体外表达分析确认该MLH1变异的致病性**
qRT-PCR显示所有转染重组质粒的HEK-293T细胞组中MLH1转录本稳定表达。Western blot分析表明：空载体组无MLH1蛋白表达；野生型MLH1稳定表达；已知良性变异p.Val716Met表达量与野生型相当（>50%）；已知致病性变异p.Ala681Thr表达量显著降低（<50%）。关键的是，p.Leu155ProfsTer17变异的全长MLH1蛋白完全检测不到（由于提前截短到155位氨基酸，失去了抗体的C端表位）。根据InSiGHT变异分类标准，MLH1中第743密码子之前产生提前终止密码子的变异可无需额外体外MMR活性检测而直接归类为致病性。该变异满足ACMG/AMP标准（PVS1、PS3、PM2、PP1、PP4），确认为致病性变异。
**3.6 生物信息学分析证实该MLH1变异的致病性**
同源建模显示p.Leu155ProfsTer17截短变异位于MLH1蛋白N端ATP酶结构域。该N端区域高度保守，包含ATP酶结构域及MSH2结合基序。提前终止密码子破坏了ATP酶结构域并导致MSH2结合基序完全丢失。此外，截短导致多个关键功能区域缺失：与EXO1的相互作用域（约第410–650位氨基酸）、MLH1和PMS2核输入所需的核定位信号（NLS，第471–474位氨基酸）、以及PMS2异源二聚化所需的C端结构域（CTD）。移码后产生的16个新氨基酸残基为无意义序列，无法参与错配修复反应。
**3.7 LS家系的健康管理**
根据NCCN指南（2019版），对7名确认携带者实施风险管理：每1–2年进行结肠镜和食管胃十二指肠镜检查；每年进行尿常规和神经系统检查。3名女性携带者（III:10、III:19、III:20）额外建议每年至每两年进行子宫内膜活检、经阴道超声和CA-125检测。随访结果：先证者（III:10）2021年发现子宫内膜息肉（1cm×0.5cm）并切除，2022年发现宫颈管息肉（0.7cm×0.3cm）并切除；携带者III:19在第二轮监测（2023年）中发现乙状结肠癌并接受根治性结肠切除术；III:8和III:20发现肠道息肉并经内镜切除；III:4和IV:1至今未出现临床表型。
**4. 讨论总结**
本研究通过鉴定一个新的MLH1胚系移码突变c.463dupC，从遗传学上确认了一个中国LS家系。研究人员对该突变携带者实施了包括定期结肠镜、食管胃十二指肠镜、尿常规、神经系统检查及女性妇科监测在内的结构化风险管理方案，促进了与MLH1突变相关的CRC和肠外恶性肿瘤的早期发现。该前瞻性监测成功早期检测并干预了多种病变：先证者发现子宫内膜和宫颈息肉；一位表亲确诊结肠癌；一位兄弟和另一位表亲发现结肠息肉，均获得及时治疗。
MLH1基因c.463dupC移码突变（p.Leu155ProfsTer17）的致病性通过多种证据支持：突变Taster软件预测、家系中3名携带者患结肠癌的共分离证据、体外Western blot证实全长蛋白完全缺失、生物信息学分析显示N端ATP酶结构域严重破坏及多个功能区域丢失。与文献报道的其他N端截短变异一致，该变异导致MLH1蛋白缺乏ATP酶活性、严重不稳定、无法与PMS2形成稳定的MutLα异源二聚体复合物，从而引起MMR功能缺陷。尽管qRT-PCR显示转录本稳定表达，但蛋白表达近乎消失，这是因为所用pcDNA3.1 cDNA表达系统缺乏内含子-外显子边界从而逃逸无义介导的mRNA降解（NMD），蛋白丢失主要由翻译后降解驱动。
本研究的局限性包括：HEK-293T细胞系的体外功能验证的非结肠起源限制（但先证者肿瘤组织IHC显示MLH1和PMS2完全缺失，弥补了这一不足）；临床随访时间相对较短，长期生存数据尚未获得；家系中其他已故或在外院治疗的患病成员的肿瘤组织蜡块无法获取，无法进行回顾性分子分析。
该突变导致MLH1蛋白多个关键功能域（包括与EXO1相互作用区域、核定位信号等）丢失，移码产生的新氨基酸序列形成无意义肽链，无法参与正常错配修复反应。作为MMR通路的核心组分，MLH1功能丧失严重损害整个MMR系统的正常运行。
目前LS相关CRC的治疗以手术为主，指南建议高度个性化的手术决策。dMMR状态是指导辅助化疗策略的关键因素。本研究中鉴定出的MLH1移码突变代表了错配修复缺陷dMMR/MSI-H CRC的典型分子特征。dMMR/MSI-H CRC中编码区含有微卫星序列的基因易发生移码突变，导致高突变负荷和新的移码肽（即新抗原）产生。LS患者的免疫系统可产生针对肿瘤相关抗原的特异性T细胞应答，同时肿瘤微环境（TME）呈现促炎细胞因子特征，但也存在多种免疫抑制机制（如MHC I类抗原呈递受损、TGF-β受体突变、Treg细胞富集、PD-L1表达上调）。美国FDA已批准pembrolizumab用于治疗既往治疗进展的不可切除或转移性dMMR/MSI-H CRC患者，nivolumab单药及联合ipilimumab也获批该适应症。在MSH2缺陷CRC小鼠模型中，联合接种四种免疫原性移码肽（FSPs）疫苗显著增强了FSP特异性适应性免疫，减少了肠道肿瘤负荷并延长了总生存期，为LS相关CRC的新型治疗和预防策略提供了支持。
总结：本研究报道了一个典型LS家系，通过NGS和Sanger测序鉴定出一个新发MLH1 c.463dupC突变（之前未报道，在大型群体数据库中缺失，分类为可能致病性）。临床和遗传特征分析显示该变异在携带者中与疾病共分离。对携带者实施标准化风险管理已取得初步积极成效。体外表达分析与残基保守性和结构-功能预测一致，证实产生的MLH1 p.L155Pfs*17蛋白无功能，导致错配修复缺陷。根据InSiGHT MMR变异分类标准，MLH1 c.463dupC被归类为致病性变异，确认为该家系LS的遗传病因。需要注意的是，本研究基于单个四代家系，限制了结果的普适性；该变异在大型群体和疾病数据库（LOVD、ClinVar、HGMD、1000 Genomes、ExAC、gnomAD）中均无报道，未来多中心研究和持续监测有助于确定其在更广泛人群中的发生率。
**5. 结论翻译**
本研究报道了一个典型的LS家系，并成功在MLH1（NM_000249.3）外显子6中鉴定出一个新的移码突变（c.463dupC；p.L155Pfs*17）。通过系统性的致病性验证，MLH1 c.463dupC变异被归类为致病性，从而丰富了LS的突变谱。本研究确认该致病性变异是该家系LS的主要遗传病因。此外，对家系成员实施系统性风险管理干预已显现初步成效，强调了LS家系标准化健康管理的关键重要性和必要性。
