解码糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)中的ceRNA(competing endogenous RNA)网络：鉴定MEG3作为枢纽(hub)长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)及治疗靶点

《Gene Reports》：Decoding the ceRNA network in diabetic retinopathy: Identification of MEG3 as a hub lncRNA and therapeutic target

　　

摘要：糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病 mellitus 的微血管并发症，主要累及20–65岁人群，占全球视力丧失原因的2.6%。早期常无症状或仅有轻微视力障碍，可进展至严重失明，因此亟需新型药物靶点。本研究旨在通过整合计算生物学方法鉴定潜在的lncRNA药物靶点，并构建与DR相关的ceRNA(lncRNA–miRNA–mRNA)网络。研究人员对高糖处理的ARPE-19细胞中lncRNA和mRNA及增生性糖尿病视网膜病变(proliferative DR, PDR)患者玻璃体标本中miRNA进行差异表达(differential expression)分析。基于ceRNA假说构建lncRNA–miRNA–mRNA网络，并通过拓扑分析及基因集分析(gene set analysis, GSA)鉴定枢纽lncRNA。研究发现572个差异表达mRNA(differentially expressed genes, DEGs)、87个差异表达miRNA(differentially expressed miRNAs, DEMs)及244个差异表达lncRNA(differentially expressed lncRNAs, DELs)与DR相关。所得ceRNA网络含59个DELs、240个DEGs及66个DEMs，经344个节点和573条边连接，其中MEG3与OLMALINC被确定为关键枢纽lncRNA。对MEG3和OLMALINC关联mRNA的GSA揭示了参与DR发病的重要生物学过程与通路。研究人员利用GSE60436数据集人样本验证lncRNA，发现ceRNA网络中枢纽lncRNA MEG3与FDA批准药物庆大霉素(gentamicin)的结合亲和力高于其他受试药物，因其结合位点更多，提示可能通过增强MEG3表达发挥保护作用。综上，本研究为DR中ceRNA介导的调控提供了新见解，并提示MEG3可作为预防DR的潜在枢纽lncRNA，值得进一步实验验证。

论文解读：Decoding the ceRNA network in diabetic retinopathy: Identification of MEG3 as a hub lncRNA and therapeutic target

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病常见的微血管并发症，是全球工作年龄人群致盲的首要原因之一，目前缺乏有效的早期分子诊断标志物及靶向治疗手段。已有研究表明长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)及竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)调控网络在DR病程中发挥重要作用，但具体哪些lncRNA作为关键枢纽(hub)分子参与高糖环境下视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial, RPE)的ceRNA调控尚不清楚。为此，研究人员通过生物信息学整合分析与分子对接方法，旨在从高通量测序数据中筛选DR相关的差异表达lncRNA、mRNA和miRNA，构建lncRNA–miRNA–mRNA ceRNA网络并识别hub lncRNA，进一步通过独立临床数据集验证其表达，并采用RNA–小分子对接预测可结合并上调hub lncRNA的FDA批准药物，探讨其作为DR防治新靶点的潜力。该论文发表于《Gene Reports》。

主要关键技术方法

研究人员使用两个GEO(Gene Expression Omnibus)数据集：ARPE-19细胞正常与高葡萄糖(72 h)处理前后的lncRNA与mRNA表达谱(GSE233164, n=3 vs 3)，以及PDR(增生性糖尿病视网膜病变)患者与对照者玻璃体液小RNA测序miRNA表达谱(GSE199852, n=4 vs 4)。经Trimmomatic去除接头及低质量序列、STAR比对至GRCh38人参考基因组、featureCounts定量后，用DESeq2筛选差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs |log₂FC|>2, adj. p<0.05)、差异表达lncRNA(differentially expressed lncRNAs, DELs |log₂FC|>2, adj. p<0.05)及差异表达miRNA(differentially expressed miRNAs, DEMs |log₂FC|>1.5, adj. p<0.05)。lncRNA–miRNA互作对由LncBase Predicted v.3预测，mRNA–miRNA互作对取miRDB、MiRTarBase和TargetScan三库中至少两库共有结果。将共有互作对导入Cytoscape构建ceRNA网络，以节点度(degree)>5及较高介数中心性(betweenness centrality, BC)筛选hub分子。对hub lncRNA关联mRNA行DAVID 6.8基因本体(gene ontology, GO)与KEGG通路富集分析。用独立人PDR样本数据集GSE60436(对照3例，PDR 6例)验证hub lncRNA差异表达。采用RIsearch2预测miRNA与MEG3结合位点，RNAFold预测MEG3二级结构，Schr?dinger Maestro对FDA批准药物库行RNA–小分子分子对接，评估结合能及相互作用。

3.1. Dataset and quality assessment of the reads

对GSE233164中6个样本的raw reads进行质控与过滤，FastQC与MultiQC显示所有样本Phred评分>30，数据质量合格可用于下游分析。

3.2. Screening of DELs, DEGs and DEMs

比较高糖与正常葡萄糖ARPE-19细胞筛选出244个DELs与572个DEGs；分析PDR患者玻璃体样本得到87个DEMs。火山图展示其分布。进一步预测获得111对lncRNA–miRNA互作(涉及244个lncRNAs与87个miRNAs)及475对mRNA–miRNA互作(涉及572个mRNAs与87个miRNAs)。

3.3. ceRNA network associated with DR

整合上述互作构建ceRNA网络，包含59个lncRNAs、240个mRNAs、66个miRNAs，形成344个节点与573条边，其中31个miRNAs、2个lncRNAs及5个mRNAs节点度>5。

3.4. Gene set enrichment analysis

对网络中240个关联mRNAs行GSA，获90个显著富集GO条目(57个生物学过程biological process, BP；15个分子功能molecular function, MF；18个细胞组分cellular component, CC；p<0.05)及12条显著KEGG通路，其中氨基酸转运、白细胞介素结合、血管收缩等GO项及铁死亡(ferroptosis)、cAMP信号、MAPK信号等KEGG通路与DR病理密切相关。

3.5. Topological analysis of the ceRNA network

按degree>5及高BC筛选hub节点，确定2个hub lncRNAs——MEG3(degree=14, BC=0.11)与OLMALINC(degree=6, BC=0.02)，以及若干hub mRNAs(SLC5A3、TXNIP等)。

3.6. Key ceRNA subnetworks

分别构建MEG3亚网(1 lncRNA–14 miRNAs–84 mRNAs)与OLMALINC亚网(1 lncRNA–6 miRNAs–42 mRNAs)。MEG3关联mRNAs富集于负调控腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号、细胞–细胞黏附、血小板活化、血–视网膜屏障(blood–retinal barrier, BRB)转运、NF-κB信号及铁死亡等DR相关BP与KEGG通路；OLMALINC关联mRNAs主要富集内质网(endoplasmic reticulum, ER)蛋白加工通路及ER应激相关BP。

3.7. Validation of key lncRNAs as hub genes in human samples

对GSE60436再行差异分析，MEG3在PDR人中显著下调(log₂FC≈?1.70, p<0.05)，OLMALINC未见差异表达，确认MEG3为DR潜在生物标志物。

3.8. Identification of the binding site of miRNAs in MEG3及小分子对接

预测hsa-miR-31-5p与hsa-miR-196a-5p为DR中上调且与MEG3结合的miRNA，其中hsa-miR-31-5p与MEG3结合能

讨论与结论翻译

研究人员讨论指出，构建的ceRNA网络及富集分析揭示了氨基酸转运、BRB破坏、NF-κB活化、铁死亡及白细胞跨内皮迁移等DR核心病理过程受MEG3关联mRNAs调控。MEG3在高糖环境下下调与既往文献一致，其过表达可抑制视网膜内皮细胞凋亡与新生血管生成。OLMALINC主要关联ER蛋白加工及ER应激，亦参与DR发病。局限包括样本量偏小、细胞系与临床样本来源不同及纯计算预测需实验验证。

Conclusion(结论原文浓缩翻译)：

本研究阐明lncRNA MEG3在铁死亡、ER应激、白细胞内皮迁移及负调控腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号、细胞–细胞黏附、血小板活化、BRB转运、NF-κB信号等DR相关生物学过程中起关键作用。所建ceRNA网络揭示lncRNA–miRNA–mRNA间复杂互作。人样本验证证实MEG3在PDR中表达降低。MEG3是有前景的DR枢纽lncRNA及治疗靶点，分子对接显示FDA批准药物gentamicin与MEG3结合亲和力良好，可能通过占据miRNA结合位点提升MEG3有效水平，值得后续实验探究其在DR防治中的转化价值。

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