(Pro) 肾素受体在阿霉素诱导的心肌病中的作用

《IJC Heart & Vasculature》：Role of (pro) renin receptor in adriamycin-induced cardiomyopathy

　　

目的：(Pro) 肾素受体（PRR）是肾素-血管紧张素系统（RAS）中一个新近被认识的元件，与心血管疾病相关。然而，PRR在阿霉素诱导的心肌病（ADR-CM）——表现为心功能下降或心力衰竭症状/体征——中的确切作用仍不完全清楚。方法：通过腹腔注射阿霉素（ADR）建立ADR-CM大鼠模型。用ADR刺激原代新生大鼠心肌细胞（NRCMs）和心脏成纤维细胞（NRCFs）。合成并应用PRR抑制剂PRO20以评估其对ADR-CM大鼠的影响。通过转染含有PRR和PRR-shRNA的重组腺病毒在大鼠和细胞中实现PRR基因过表达和沉默。使用ERK抑制剂PD98059抑制细胞中磷酸化ERK1/2（pERK1/2）。结果：PRR在ADR-CM以及ADR刺激的NRCMs和NRCFs中显著上调。体内实验表明，PRR过表达加剧了ADR诱导的心功能不全和心肌肥厚，而全身给予PRO20则减轻了ADR诱导的这种效应。在体内和体外实验中，全身给予PRO20和PRR基因敲低减轻了ADR诱导的纤维化、炎症反应、凋亡和氧化应激，而PRR过表达则产生相反效果。抑制PRR降低了ADR诱导的心脏肾素活性、血管紧张素II（Ang II）浓度和pERK1/2蛋白水平，而PRR过表达在ADR存在下增加了这些指标。PD98059减轻了ADR处理的NRCFs中的心肌细胞纤维化、炎症反应、凋亡，并降低了NOX2丰度和NOX活性。结论：PRR参与ADR-CM的病理进展，抑制PRR可能代表一种新颖且有前景的ADR-CM治疗策略。

阿霉素（adriamycin, ADR）是一种高效抗肿瘤药物，但其累积性心脏毒性常导致扩张型心肌病和充血性心力衰竭，即阿霉素诱导的心肌病（ADR-CM）。肾素-血管紧张素系统（RAS）失调在ADR-CM中发挥关键作用，但作为RAS新组分的(Pro)肾素受体（PRR）在ADR-CM中的确切功能尚未明确。为此，研究人员利用PRR特异性抑制剂PRO20及携带PRR或PRR-shRNA的重组腺病毒，在体内和体外系统探索PRR对ADR-CM的调控机制。研究发现，PRR通过激活心脏RAS和ERK1/2信号通路，促进心肌纤维化、炎症、凋亡和氧化应激，进而加剧心功能不全与心脏重塑；而抑制PRR则可显著改善这些病理变化。该论文发表在《IJC Heart》。

研究人员主要采用以下关键技术方法：建立ADR-CM大鼠模型（腹腔注射ADR，总累积剂量15 mg/kg，来自Wistar大鼠）；提取原代新生大鼠心肌细胞（NRCMs）和心脏成纤维细胞（NRCFs）（均源自Wistar大鼠幼崽）；合成PRR抑制剂PRO20；构建并转染重组腺病毒（AdMax系统）实现PRR基因过表达（PRR）或敲低（PRR-shRNA）；使用ERK抑制剂PD98059；通过实时定量PCR、Western blot、免疫组化、Masson染色、TUNEL染色、ELISA及酶活性测定等技术检测相关指标。

**3.1 PRR丰度在ADR刺激的NRCMs和大鼠心脏组织中增加**。通过浓度梯度和时间梯度实验发现，ADR处理以浓度和时间依赖性方式上调NRCMs中PRR mRNA和蛋白水平；在ADR-CM大鼠模型中，心肌PRR丰度随时间逐渐升高，免疫组化和实时定量PCR结果一致。

**3.2 五组大鼠的体重、血压和死亡率**。与对照组相比，ADR处理显著降低体重和血压，但不影响心率；PRR过表达或PRO20治疗对体重和血压无额外影响。生存分析显示，PRR过表达进一步增加死亡率（85%），而PRO20显著降低死亡率（37.5%），对照和ADR-CM+EGFP组死亡率分别为0%和62.5%。

**3.3 PRR在ADR诱导的左心室功能障碍和心肌肥厚中的作用**。超声心动图显示，ADR-CM和ADR-CM+EGFP组左心室射血分数（LVEF）、缩短分数（FS）和E/A比值显著降低，左心室收缩末期内径（LVESD）和舒张末期内径（LVEDD）增加；PRR过表达进一步恶化上述指标，而PRO20治疗则改善心功能。H&E染色表明PRR过表达加剧心肌结构紊乱和心肌细胞增大，PRO20逆转此变化。

**3.4 PRR在ADR诱导的心肌纤维化和炎症反应中的作用**。Masson三色染色和免疫组化显示，ADR-CM组胶原含量、胶原I和胶原III水平显著升高；PRR过表达进一步增强这些变化，而PRO20抑制胶原沉积。Western blot证实PRR过表达上调结缔组织生长因子（CTGF）和转化生长因子-β1（TGF-β1）蛋白水平，PRO20下调。炎症指标方面，PRR过表达增加白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）蛋白水平，PRO20和PRR基因敲低则减轻炎症反应。

**3.5 PRR在ADR诱导的心肌凋亡和氧化应激中的作用**。TUNEL染色显示，ADR-CM组凋亡细胞比例升高，PRR过表达进一步增加凋亡，PRO20减少凋亡。Western blot表明PRR过表达上调Bax/Bcl-2比值和剪切型caspase-3（C-caspase-3）蛋白水平，PRO20逆转。氧化应激指标方面，PRR过表达增加NOX2、4-羟壬烯醛（4-HNE）蛋白水平、丙二醛（MDA）含量和NADPH氧化酶（NOX）活性，并降低超氧化物歧化酶（SOD）活性；PRO20则有效缓解氧化损伤。

**3.6 PRR在ADR诱导的心脏RAS激活和ERK1/2信号通路中的作用**。在ADR-CM模型中，心脏PRR mRNA和蛋白水平、肾素活性、血管紧张素II（Ang II）浓度及磷酸化ERK1/2（pERK1/2）蛋白水平均显著升高；PRR过表达进一步增强这些指标，而PRO20抑制肾素活性、Ang II浓度和pERK1/2水平。这表明PRR介导了ADR诱导的心脏RAS激活和ERK1/2信号活化。

**3.7 PRR敲低消除ADR增强的纤维化、炎症、凋亡、氧化应激和pERK1/2水平（NRCFs中）** 。转染PRR-shRNA敲低NRCFs中PRR后，ADR诱导的纤维化标志物（胶原I、TGF-β）、凋亡标志物（C-caspase-3）、氧化应激指标（NOX2、NOX活性）、炎症因子（IL-6、TNF-α）和pERK1/2蛋白水平均显著下降，与体内结果一致。

**3.8 ADR诱导的纤维化、炎症、凋亡及NOX2丰度和NOX活性增加由PRR-ERK1/2通路介导（NRCFs中）** 。使用PD98059抑制pERK1/2后，ADR引起的纤维化、炎症、凋亡及NOX2/NOX活性增加均被抑制；PRR过表达加剧上述反应，而PD98059可逆转PRR过表达的促进作用。这证实PRR通过ERK1/2信号通路参与ADR诱导的心脏成纤维细胞病理变化。

在讨论中，研究人员整合了现有文献与本研究发现，指出PRR在ADR-CM中通过双重机制发挥作用：一方面通过激活心脏RAS（增加肾素活性和Ang II生成）的Ang II依赖性途径，另一方面通过直接激活ERK1/2信号的Ang II非依赖性途径。这两种途径共同促进心肌纤维化、炎症、凋亡和氧化应激，最终导致心功能不全和心脏重塑。PRO20治疗和PRR基因敲低可有效阻断这些病理效应。研究结论为：PRR参与ADR-CM的病理进展，抑制PRR可能代表一种新颖且有前景的ADR-CM治疗策略。