工程化黄酮类化合物通过破坏线粒体AIF/CHCHD4复合物实现靶向癌症治疗

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Engineered flavonoid disrupts mitochondrial AIF/CHCHD4 complex for targeted cancer therapy

　　

癌症代谢依赖于多方面的机制，包括线粒体与细胞核之间的双向细胞器间通讯，这种通讯促进了细胞在转录组学、蛋白质组学和代谢组学水平上的适应性调整。由凋亡诱导因子（AIF）和卷曲螺旋结构域蛋白4（CHCHD4）组成的线粒体蛋白质复合物对于这种线粒体-核通讯至关重要。AIF/CHCHD4复合物介导富含半胱氨酸的核基因编码蛋白质向线粒体的输入，从而使线粒体蛋白质组适应细胞的能量需求。在此，研究人员报告了M30-E05的发现，这是一种与AIF的NADH口袋结合的化合物，可阻止其二聚化并破坏AIF/CHCHD4复合物，这一点通过分子对接和线粒体AIF/CHCHD4底物表达的凝胶电泳分析得以证实。在癌细胞中，M30-E05降低核基因编码线粒体蛋白如AIF、CHCHD4、细胞色素c氧化酶铜伴侣蛋白（COX17）和线粒体钙摄取蛋白1（MICU1）的表达。此外，M30-E05使线粒体网络碎片化并损害线粒体呼吸功能，引起葡萄糖、脂质和氨基酸代谢方面的深刻改变，这一点通过氧消耗动力学测量和质谱代谢组学分析揭示。重要的是，M30-E05显著降低了包括来自骨肉瘤患者来源异种移植物（PDX）的人成人和儿童骨肉瘤癌细胞 panel 的活力，并诱导细胞凋亡。当对免疫缺陷NSG小鼠口服给药两周后，M30-E05在皮下PDX异种移植物模型中抑制了肿瘤生长，且没有明显的毒性。研究人员预期M30-E05作为首创代谢抑制剂，可以作为新型抗肿瘤药物的先导化合物。

该论文于《Acta Pharmaceutica Sinica B》发表，聚焦癌症代谢重编程这一核心科学问题展开研究。癌细胞通过代谢灵活性在不同能量底物间切换并平衡合成代谢与分解代谢以适应肿瘤微环境，其中线粒体与细胞核之间的双向通讯对癌细胞适应性至关重要。AIF/CHCHD4复合物调控富含半胱氨酸的核编码线粒体蛋白的输入，影响呼吸链生物发生、氧化还原调控及线粒体超结构维持。尽管AIFM1功能缺失突变与X连锁线粒体疾病相关，但AIF在未突变状态下的潜在促癌作用已在KRAS突变肺癌模型中得到证实，且CHCHD4亦被证明通过呼吸链介导的代谢促进肿瘤增殖。基于此，研究人员假设靶向破坏AIF/CHCHD4蛋白复合物可降低癌细胞代谢灵活性并诱导其死亡，进而开展本项研究。

该研究旨在发现能够破坏AIF/CHCHD4复合物的特异性小分子抑制剂，并验证其抗癌活性。研究结论表明，M30-E05通过竞争性结合AIF的NADH口袋、阻止其二聚化，从而破坏AIF/CHCHD4复合物，导致核编码线粒体蛋白输入障碍、线粒体功能损伤及代谢重编程，最终诱导caspase激活依赖的凋亡并显著抑制骨肉瘤生长。该研究首次实现了对AIF/CHCHD4复合物的化学靶向干预，为开发新型代谢靶向抗肿瘤药物提供了概念验证和先导化合物，对克服化疗耐药具有重要临床意义。

研究主要采用了以下关键技术方法：基于AlphaScreen技术的机器人化高通量筛选平台用于鉴定AIF/CHCHD4相互作用抑制剂；分子动力学模拟结合AutoDock Vina分子对接进行化合物与AIF结合模式及稳定性分析；RNA测序（涵盖MAPPYACTS队列42例难治/复发骨肉瘤患者及OS2006队列82例初诊患者）结合基因集富集分析和GO富集分析； Seahorse XFe96能量代谢分析平台检测氧消耗率（OCR）和糖酵解速率（glycoPER）；¹³C核磁共振示踪联合质量同位素体通量分析（tcaCALC建模）；气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）和超高效液相色谱-三重四极杆质谱（UHPLC-MS/MS）代谢组学分析；共聚焦免疫荧光显微镜和透射电子显微镜观察线粒体形态及AIF亚细胞定位；免疫共沉淀和蛋白质免疫印迹验证复合物解离及蛋白表达变化；以及患者来源异种移植物（PDX）的体内药效评估。

**M30-E05的发现与合成验证**：通过针对AIF/CHCHD4蛋白-蛋白相互作用的高通量筛选，研究人员从Prestwick FDA批准药物库（1280种化合物）、法国国家化学库（2901种化合物）及BioCIS新化合物库（99种化合物，含131种黄酮衍生物）中鉴定出M30-E05为最优AIF/CHCHD4复合物破坏剂。该化合物以芹菜素（diosmetin）为起始原料经7步合成，可在多克规模制备。在验证实验中，N27肽（CHCHD4 N端27个氨基酸残基）作为阳性对照可完全阻断AIF/CHCHD4相互作用，而M30-E05在10 μmol/L浓度下表现出最优的复合物解离活性。

**M30-E05与AIF结合的分子机制**：计算研究表明M30-E05以-8.5±0.7 kcal/mol的结合自由能优先结合AIF单体的NAD结合口袋，该结合位点与两个高效Prestwick化合物（PW02、PW04）一致。1微秒分子动力学模拟显示AIF-M30-E05复合物结构达到平衡稳定，配体未引起显著全局构象变化。M30-E05的两个末端基团与AIF的疏水氨基酸（A374、I375、G376、V378）及极性残基（P144、R165）建立额外相互作用，提示其可能通过竞争性抑制NAD结合来阻止AIF二聚化。小鼠AIF（PDB ID: 1GV4）对接实验显示类似结合模式（结合自由能-9.0±0.7 kcal/mol），为体内实验提供支持。

**细胞与分子作用机制**：在骨肉瘤细胞中，Kaplan-Meier分析显示AIFM1和CHCHD4高表达与患者总生存期缩短相关。M30-E05对8种儿童骨肉瘤细胞系的IC₅₀约为10 μmol/L，且对阿霉素耐药株（HOS-R/DOXO）和甲氨蝶呤耐药株（HOS-R/MTX）保持同等效力，同时在成人肺癌、卵巢癌、胰腺癌及白血病细胞系中亦表现出细胞毒性，其中卵巢癌和部分白血病细胞系最为敏感（IC₅₀ 2-3 μmol/L）。克隆形成实验证实M30-E05可完全消除耐药细胞系的长期存活能力。药物组合实验显示M30-E05与阿霉素在HOS-R/DOXO细胞中具有最高协同评分（ZIP评分50.488），与甲氨蝶呤在HOS-R/DOXO及与阿霉素在HOS-R/MTX中亦存在协同作用，而在亲代HOS细胞中仅表现为加性效应。siRNA敲低AIF使M30-E05效力降低2倍，验证了其靶向特异性；且该化合物在高达100 μmol/L时对人外周血单个核细胞（PBMC）无毒性，对HEK293细胞的IC₅₀约为62 μmol/L。

RNA测序GO分析显示M30-E05处理后凋亡通路显著富集（P值=0.0372），促凋亡基因TP53、PARP4、ITPR1上调而抗凋亡基因BCL2L1（BCL-X_L）、MCL1下调。Annexin V/PI双染显示M30-E05从48小时起显著诱导早期和晚期凋亡，caspase-3和caspase-9切割比例增加1.5-2倍。然而共聚焦免疫荧光显示AIF_supply>虽发生线粒体网络碎片化及向核周重定位，但AIF仍定位于线粒体（Pearson相关系数0.872/0.844），未发生核转位（Pearson相关系数-0.020/-0.039），表明M30-E05诱导的是caspase激活依赖的AIF非依赖性凋亡。

**能量代谢与线粒体功能影响**：免疫共沉淀证实M30-E05处理1小时后即出现AIF/CHCHD4相互作用破坏，6小时内AIF和CHCHD4蛋白水平下降，其底物MICU1和COX17亦相应减少，而线粒体外膜蛋白VDAC不变表明线粒体质量未受影响。Seahorse分析显示M30-E05从6小时起降低OCR并增加glycoPER，导致ATP产生从氧化磷酸化向糖酵解转移。透射电子显微镜显示线粒体变圆、基质密度增加及嵴溶解。¹³C-NMR示踪和tcaCALC建模表明丙酮酸脱氢酶（PDH）通量接近1.0且M30-E05未显著改变三羧酸循环底物选择或相对通量比例，说明其降低的是绝对氧化通量而非代谢途径选择。GC-MS/MS代谢组学揭示短链和长链脂肪酸β氧化、精氨酸和脯氨酸等氨基酸代谢通路发生显著改变。

**患者来源异种移植物效应**：6个骨肉瘤PDX模型的体外二次培养显示M30-E05的IC₅₀为17-40 μmol/L，与顺铂和依托泊苷相当。所有PDX模型经M30-E05处理后基底OCR降低，部分模型中AIF、MICU1和CHCHD4蛋白水平下降。PDX模型间线粒体形态和超结构存在异质性，与其移植部位（皮下或原位/旁胫骨）及基底OCR差异相关。

**体内安全性与抗肿瘤活性**：M30-E05在18种人靶点筛选中仅对5-HT_2B受体、多巴胺转运体、Nav1.5钠通道和PDE4D2有中等强度作用，对hERG钾通道（心脏毒性主要效应器）和Lck酪氨酸激酶（T细胞活化关键）无抑制。NSG小鼠4周剂量递增实验（10-100 mg/kg口服，每周5天）显示行为、外观、体重及心肌肌钙蛋白I（TNNI3）水平均无异常，主要器官组织学形态正常。在GR-OS-18 PDX皮下移植瘤模型中（该PDX具有最高AIF和CHCHD4表达），100 mg/kg M30-E05口服给药2周使肿瘤生长显著降低41%，Ki-67增殖指数下降，AIF蛋白表达降低。液相色谱-质谱检测显示M30-E05口服后特异性分布于骨组织，未在脾、肝、肾、肺、血浆、心和脑中检测到。

在讨论部分，研究人员指出M30-E05作为新型化学修饰黄酮类化合物，通过原创性生物学机制——竞争性抑制AIF的NAD结合位点、阻止其二聚化从而破坏AIF/CHCHD4复合物——实现癌症特异性代谢重编程的靶向干预。该化合物可克服药物外排泵介导的耐药性，对多药耐药骨肉瘤具有显著活性，且与化疗药物存在协同增效作用。其口服生物利用度、骨组织靶向分布及缺乏主要器官毒性的特点，使其相较于直接抑制氧化磷酸化的药物具有安全性优势（如某复合体I抑制剂在晚期实体瘤和急性髓系白血病的I期临床试验中失败）。研究人员亦提出未来优化方向：开发纳米制剂或抗体-药物偶联物、设计更高活性类似物、筛选更敏感癌种、以及与放疗或免疫治疗联用。对于分子机制的深入研究，建议通过突变AIF关键结合位点氨基酸（如F310、L311、F482）并经等温滴定量热法和动态扫描荧光技术验证，以进一步确认M30-E05的作用模式。

研究结论翻译：M30-E05是一种新型化学修饰的黄酮类化合物，通过靶向破坏AIF/CHCHD4复合物的原创性生物学机制作用于癌症特异性代谢重编程。该化合物可能成为难治性和复发性癌症患者的有价值治疗选择，可作为单药或联合治疗方案应用。