硒纳米酶通过特异性激活硒蛋白阻断氧化应激损伤及cGAS-STING信号通路有效干预类风湿关节炎

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Selenium nanozymes effectively treat rheumatoid arthritis by specifically activating selenoproteins to block oxidative damage and cGAS-STING signaling pathway

　　

氧化还原失衡已成为类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）进展的重要影响因素，前期研究表明硒纳米酶（selenium nanoparticles, Se NPs）可通过恢复氧化还原平衡有效干预RA。然而，Se NPs调控RA的具体过程，特别是Se NPs激活硒蛋白（selenoproteins）抑制炎症的分子机制尚不明确。为此，研究人员首先分析了RA患者的氧化还原失衡状态，并通过mRNA谱分析鉴定了与巨噬细胞炎症相关的硒蛋白。随后，研究人员合成了具有谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPX）样活性的Se NPs作为补充剂，发现Se NPs在体外和体内模型中可特异性上调巨噬细胞内的硒蛋白表达；进一步结合其GPX样活性，Se NPs可快速清除活性氧和活性氮物质（reactive oxygen and nitrogen species, RONS），恢复RA的氧化还原稳态，并通过有效抑制巨噬细胞炎症缓解RA症状。机制研究表明，Se NPs通过特异性激活硒蛋白，有效防止线粒体和核DNA（nuclear DNA, nDNA）损伤，阻断DNA与环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶（cyclic GMP–AMP synthase, cGAS）的相互作用，抑制cGAS-干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes, STING）及核因子κappa-B（nuclear factor kappa-B, NF-κB）通路的激活，从而有效抑制巨噬细胞炎症并发挥治疗RA的作用。因此，该研究揭示了Se NPs抑制巨噬细胞炎症的机制，为炎症性疾病的治疗提供了新的潜在治疗靶点。

该研究发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》，系统揭示了硒纳米酶（Se NPs）调控硒蛋白-氧化还原失衡-炎症关系轴治疗类风湿关节炎（RA）的分子机制。以下从研究背景、技术方法、研究结果及研究结论等方面进行解读。

研究背景方面，RA是一种以慢性炎症和关节外损伤为特征的常见结缔组织病。长期以来，T细胞和B细胞介导的自身免疫反应被认为是RA发病的主要因素，但约20%患者对传统治疗不敏感。近年研究表明，先天免疫细胞特别是滑膜巨噬细胞在RA持续炎症激活中发挥上游信号作用。RA微环境中糖酵解异常导致严重的氧化还原失衡，产生过量活性氧和活性氮物质（RONS），不仅直接造成关节软骨氧化损伤，还作为炎症反应的放大器。过量RONS可快速诱导巨噬细胞线粒体和核DNA损伤，受损的线粒体DNA（mtDNA）和基因组DNA易与相关蛋白形成自身抗原复合物，被DNA感受器cGAS识别后催化环磷酸鸟苷-腺苷酸（cGAMP）合成，激活cGAS-STING信号通路，触发下游免疫激活，放大炎症级联反应。基于氧化还原失衡在RA中的关键作用，研究人员前期开发了具有GPX样活性的Se NPs，可消除巨噬细胞中过量RONS、缓解线粒体炎症诱导的氧化还原失衡，但其调控巨噬细胞炎症反应的具体机制尚不明确。特别是随着硒蛋白在破骨细胞分化和骨相关疾病调控中作用的明确，进一步揭示Se NPs内化后调控炎症反应的过程和机制尤为必要。

研究人员采用的关键技术方法包括：（1）采集RA患者外周血单核细胞进行mRNA测序，并通过免疫荧光检测滑膜组织中游离双链DNA（dsDNA）水平；（2）化学合成Se NPs并通过透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、X射线光电子能谱（XPS）等进行表征；（3）利用CCK-8法评估细胞相容性，通过GPX活性检测试剂盒评价Se NPs的GPX样活性；（4）采用激光共聚焦显微镜和流式细胞术观察Se NPs的细胞摄取与线粒体定位，通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）分析硒氨基酸代谢转化；（5）运用DCFH-DA、DAF-FM DA、Rhod-2 AM、Mito-Tracker Red CMXRos、JC-1及Calcein AM等荧光探针检测线粒体损伤指标；（6）通过彗星实验（Comet Assay）和免疫荧光检测nDNA损伤标志物；（7）采用实时定量PCR（RT-qPCR）、蛋白质免疫印迹（WB）、酶联免疫吸附测定（ELISA）检测分子标志物表达；（8）构建II型胶原诱导的关节炎（CIA）小鼠模型，通过micro-CT、步态分析、组织病理学及免疫组织化学评估治疗效果。

研究结果部分，"RA中硒蛋白-氧化还原失衡-炎症关系的分析"显示，mRNA测序获得6089个差异基因，其中3593个上调、2496个下调。GO富集分析显示差异基因主要富集于免疫应答、细胞激活等生物学过程；KEGG分析显示其富集于NF-κB信号通路、TNF信号通路和胞质DNA感受信号通路等。热图分析表明RA组中白细胞介素家族、肿瘤坏死因子超家族、基质金属蛋白酶（MMPs）家族及干扰素刺激基因（ISGs）上调；抗氧化酶基因呈现复杂变化，kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）下调而核因子红细胞2相关因子2（Nrf-2）上调，多种硒蛋白基因表达异常。同时，DNASE等DNA清除酶下调而cGAS-STING通路下游基因上调，滑膜组织免疫荧光证实RA患者存在丰富的dsDNA，表明游离DNA（cfDNA）可能增加并激活cGAS-STING通路。

"Se NPs的合成与表征"结果表明，合成的Se NPs呈红色、分散良好的球形纳米颗粒，TEM和DLS检测其粒径约100 nm，Zeta电位为-21.6 mV，在水中、PBS和DMEM中7天内保持稳定。HRTEM和XPS证实其主要含C、O、Se元素，Se以0价态存在，XRD和选区电子衍射（SAED）表明其为无定形硒。

"Se NPs的GPX活性检测与硒蛋白调控作用"结果表明，Se NPs具有浓度依赖性的GPX样活性，25 μmol/L Se NPs酶活性相当于24.95 mU天然GPX，对H₂O₂的清除效率达43.5%（100 μmol/L时达76.9%），米氏常数（Km）为30.2324 mmol/L，最大反应速率（Vmax）为269.834 μmol/L/min。CCK-8实验显示1-100 μmol/L范围内Se NPs对RAW264.7细胞无显著毒性。Se NPs（20 μmol/L）作用12 h时细胞内GPX活性达峰值，可显著上调GPX1、GPX4、SELW、SELZ、SELT、SELH等硒蛋白表达；在脂多糖（LPS）和H₂O₂诱导的氧化损伤模型中，Se NPs显著增强GPX活性，降低H₂O₂、一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）水平，有效缓解氧化损伤。

"Se NPs的细胞摄取、定位、体内分布与代谢"结果显示，Cy3标记的Se NPs呈时间依赖性进入RAW264.7细胞，4 h时与线粒体基本完全共定位。HPLC-MS分析证实Se NPs内化后代谢转化为硒半胱氨酸（含量5.25 μg/mL，较对照增加1.37倍）和硒甲硫氨酸（含量16.71 μg/mL，较对照增加7.96倍），作为合成硒蛋白的原料。体内药代动力学显示，腹腔注射后Se NPs在2 h达到血药浓度峰值，半衰期约5.5 h，主要经肝脏代谢，24 h后在肢体关节部位富集。

"Se NPs通过恢复氧化还原平衡有效抵抗巨噬细胞线粒体损伤"结果表明，Se NPs处理后LPS和H₂O₂刺激的RAW264.7细胞中DCFH-DA和DAF-FM DA荧光显著降低，线粒体Ca²⁺超载、线粒体膜电位下降、线粒体通透性转换孔（mPTP）开放及线粒体形态异常均得到有效改善，mtDNA（Mtnd1 DNA和Mtco3 DNA）泄漏减少，证实Se NPs通过GPX活性和上调硒蛋白有效保护线粒体。

"Se NPs抵抗巨噬细胞核DNA损伤"结果显示，Se NPs显著降低LPS和H₂O₂诱导的γ-H2AX和8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）表达，彗星实验显示尾部DNA减少近2倍、橄榄尾矩降低近10倍。TUNEL染色和Calcein-AM/PI双染证实Se NPs有效抑制氧化损伤导致的DNA断裂和细胞死亡，维持核DNA相对完整性。

"Se NPs通过cGAS-STING信号通路调控巨噬细胞硒蛋白-氧化还原失衡-炎症关系轴"的机制研究表明，Se NPs处理显著上调多种硒蛋白和抗氧化酶mRNA表达，降低线粒体和DNA损伤标志物及炎症介质表达。免疫荧光和WB分析证实，Se NPs通过增强GPX样活性和硒蛋白表达清除RONS，保护线粒体和核DNA完整性，减少cGAS与DNA结合，抑制cGAS-STING通路及其下游NF-κB通路激活，降低TANK结合激酶1（TBK1）、STING和p65的磷酸化水平，从而减少促炎因子产生。RT-qPCR和ELISA证实Se NPs显著降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）的mRNA水平和蛋白分泌。该机制在人单核细胞THP-1细胞中得到验证。

"Se NPs的CIA小鼠体内治疗"结果显示，从第22天开始每日腹腔注射Se NPs（1 mg/kg）治疗的CIA小鼠，第44天出现踝关节肿胀消退转折点，结束时踝关节厚度约3.0 mm，较PBS组减少约1.2 mm；临床关节炎评分降至约3分，显著低于PBS组的10分。步态分析显示Se NPs显著改善运动功能。micro-CT显示Se NPs组骨面和关节结构破坏显著减轻，骨表面与骨体积比（BS/TV）、骨矿物质密度（BMD）和组织矿物质密度（TMD）显著升高。组织病理学显示Se NPs显著缓解滑膜炎、减少炎性细胞浸润、保护软骨结构、抑制破骨细胞活化。ELISA检测显示Se NPs显著降低血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18水平。

"Se NPs体内调控硒蛋白-氧化还原失衡-炎症关系轴"的免疫荧光和免疫组织化学结果表明，Se NPs组关节软骨GPX4和BCL-2表达显著增加，dsDNA和BAX表达减少；cGAS-STING通路和NF-κB通路关键蛋白磷酸化水平及下游促炎因子表达显著降低，与体外结果一致。值得注意的是，PBS组TFAM和SELW表达异常升高，前者可能为炎症高峰期线粒体的反馈保护性表达，后者可能与破骨细胞激活有关。

研究结论部分，该研究通过体外和体内实验系统阐明了Se NPs在硒蛋白-氧化还原失衡-炎症关系轴中的调控作用。在确认RA患者存在氧化还原失衡、并通过mRNA测序鉴定出与氧化还原紊乱和炎症进展相关的硒蛋白后，研究证实Se NPs可特异性上调多种硒蛋白，增强抗氧化防御，抑制巨噬细胞线粒体和核DNA损伤，从而阻断DNA与cGAS的相互作用，抑制cGAS-STING通路及下游NF-κB通路的激活。CIA模型进一步证实Se NPs通过调控硒蛋白-氧化还原失衡-炎症关系轴发挥治疗RA的作用，并对软骨产生保护作用。该研究为RA的发病机制和治疗提供了新见解，为基于硒的纳米药物治疗RA提供了新的策略方向。