《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Gut microbiota-derived 5-HTP penetrates the host blood–brain barrier and ameliorates autism symptoms
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摘要：孤独症谱系障碍(Autism spectrum disorder, ASD)是一种高发神经发育性疾病，其与肠道微生物组的密切关联日益受到关注，但由于对共生菌与宿主神经系统互作的分子机制认识有限，针对肠道菌群的ASD治疗策略发展受阻。本研究通过鸟枪法宏基因
摘要：孤独症谱系障碍(Autism spectrum disorder, ASD)是一种高发神经发育性疾病，其与肠道微生物组的密切关联日益受到关注，但由于对共生菌与宿主神经系统互作的分子机制认识有限，针对肠道菌群的ASD治疗策略发展受阻。本研究通过鸟枪法宏基因组测序及超高效液相色谱-串联质谱(UPLC–MS/MS)靶向代谢组学分析，在人ASD患者及ASD小鼠模型的肠道微生物群中鉴定出色氨酸(Tryptophan, Trp)代谢物的改变。研究发现，共生菌来源的色氨酸代谢中间产物5-羟基色氨酸(5-hydroxytryptophan, 5-HTP)可改善上述小鼠模型的焦虑、刻板重复行为及社会交往缺陷。此外，5-HTP能够穿越血脑屏障(blood–brain barrier, BBB)，抑制受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)配体的过表达，从而抑制下游RTK/MAPK/ERK信号级联的过度激活，进而使MeCP2转基因小鼠海马区过度稳定的树突棘恢复正常。本研究证明产5-HTP的肠道原生菌可在多种ASD动物模型中改善ASD症状，阐明了肠道微生物群与ASD发生及治疗间的分子机制，为通过肠道土著菌表达神经元调节小分子来改善ASD提供了有前景的治疗思路。
论文解读：肠道微生物源5-HTP经BBB调控RTK/ERK通路改善ASD症状
孤独症谱系障碍(Autism spectrum disorder, ASD)是一种以社交沟通障碍和重复刻板行为为核心特征的神经发育疾病，发病率持续上升且发病机制尚未完全阐明。近年研究表明ASD患者普遍存在肠道菌群失调及胃肠道症状，且粪便微生物移植(Fecal microbiota transplantation, FMT)可部分改善症状，提示"肠-脑轴(gut–brain axis)"参与ASD病理过程。色氨酸(Tryptophan, Trp)代谢产物是肠-脑对话的重要介质，但特定菌群代谢物如何经循环系统作用于中枢神经并影响ASD尚不清楚。鉴于此，Li Bei等人(发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》)开展本研究，旨在鉴定ASD中差异的菌群色氨酸代谢物，明确其能否穿越血脑屏障(blood–brain barrier, BBB)及在中枢的作用机制，并验证工程益生菌递送该代谢物对ASD动物模型的行为改善效果。
主要关键技术方法：
研究人员收集20例未用药ASD患儿及20例典型发育(Typically developing, TD)儿童粪便进行宏基因组测序与UPLC–MS/MS靶向代谢组学检测；建立人ASD粪菌移植(FMT)模型(C57BL/6J受体)、MeCP2转基因(MeCP2-TG)小鼠模型及BTBR自发ASD模型；利用CRISPR-Cas9编辑大肠杆菌Nissle 1917(EcN)构建产5-HTP(EcN_5-HTP)及产5-HT(EcN_5-HT)的工程菌株并灌胃干预；采用三箱社交、埋珠、高架十字迷宫及开场实验评估行为；用氘标记示踪结合UPLC–MS/MS验证5-HTP跨BBB；通过高尔基染色、Western blot、qPCR及RNA-seq分析海马树突棘形态及RTK/MAPK/ERK通路；部分实验用ERK抑制剂SL-327及RTK受体激活剂(LM22B-10、NSC 228155)进行反向验证。
研究结果
3.1. Low level of 5-HTP in ASD children and mouse models
研究人员发现ASD患儿粪便中5-HTP水平显著低于TD儿童，而色氨酸及吲哚升高，菌群色氨酸合成酶(trpA)基因下调。MeCP2-TG小鼠也存在色氨酸代谢向吲哚及犬尿氨酸(Kynurenine)分流、5-HTP降低的现象，且接受TD小鼠共饲养可使MeCP2-TG小鼠胃肠及行为表型部分恢复，提示ASD相关菌群失调导致肠道5-HTP匮乏。
3.2. Microbiota-derived 5-HTP modulates behavioral abnormalities in different ASD mouse models
研究人员将敲除tanA并引入外源5-HTP合成途径的EcN_5-HTP灌胃ASD-FMT小鼠及MeCP2-TG小鼠，发现EcN_5-HTP(而非野生型EcN或EcN_5-HT)可显著改善社交新奇偏好缺失、减少埋珠行为并增加高架十字迷宫开放臂停留时间，在BTBR模型中亦可改善重复行为与焦虑样行为，表明菌群源性5-HTP可缓解多类ASD模型的相关行为异常，且5-HT本身无此效应。
3.3. Microbiota-derived 5-HTP ameliorates dendritic spine overproduction via ERK pathway
研究人员通过高尔基染色发现MeCP2-TG小鼠海马神经元树突分支复杂度增加、树突棘密度过高，EcN_5-HTP处理可使树突棘密度恢复正常；Western blot显示模型小鼠海马磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)水平升高，EcN_5-HTP处理使其回落至正常，ERK抑制剂SL-327可模拟5-HTP的行为改善效果，说明5-HTP通过抑制过度激活的MAPK/ERK信号通路纠正树突棘过度形成。
3.4. Inhibition of RTK ligand expression and RTK receptor activity by microbiota-derived 5-HTP
研究人员检测发现EcN_5-HTP处理后海马脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)及Neuregulin-3(NRG3) mRNA下调，TrkB与表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)磷酸化受抑；共给予TrkB激活剂LM22B-10或EGFR激活剂NSC 228155可抵消EcN_5-HTP的行为改善作用，证实5-HTP通过下调RTK配体表达并抑制RTK(TrkB/EGFR)/MAPK/ERK信号级联发挥疗效。
3.5. 5-HTP crosses the blood–brain barrier and affects host 5-HTP pools
研究人员用氘标记示踪实验发现，灌胃5-HTP-d3后1 h即可在血清检出，5 h在脑组织中达可测浓度，而灌胃5-HT-d4后脑组织始终未检出标记物；免疫荧光及UPLC–MS/MS亦显示EcN_5-HTP组小鼠脑内5-HTP水平升高而5-HT无明显变化，证实口服来源的5-HTP可穿越BBB进入中枢并补充脑内5-HTP池，而菌群源性5-HT难以入脑。
讨论与结论总结
讨论指出本研究首次在ASD背景下确立肠道微生物源性5-HTP为肠-脑轴的功能性递质，其能穿过BBB抑制RTK配体表达及RTK/MAPK/ERK信号过度活化，逆转海马树突棘异常增生从而改善ASD样行为。工程EcN持续产5-HTP较游离5-HTP试剂效果更优，可能模拟缓释特征。不同ASD模型反应差异反映ASD异质性，需个体化干预。此外5-HTP处理还降低小胶质细胞活化标记Iba1，提示潜在免疫调节作用，且γ频段脑电异常得纠正。研究局限包括未完全阐明5-HTP调控BDNF/NRG3的上游受体机制及BTBR模型具体机制。
研究结论翻译：本研究表明肠道微生物群产生的5-HTP可穿越宿主血脑屏障并通过抑制RTK/MAPK/ERK信号通路使过度稳定的树突棘正常化，从而在多种ASD动物模型中减轻孤独症症状，揭示了肠-脑互作的具体分子机制，为利用肠道土著菌表达神经元调节小分子治疗ASD及其他神经精神疾病提供了新靶点与思路。
