综述：非编码RNA调控癌症中R环动态的作用：机制与治疗意义

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：The role of non-coding RNAs in regulating R-loop dynamics in cancer: Mechanisms and therapeutic implications

　　

R环是转录过程中形成的RNA:DNA杂交体，在调控基因表达和维持基因组稳定性方面发挥关键作用。R环形成与解离的失调已被证实与基因组不稳定性相关，而基因组不稳定性是癌症的重要标志。近期研究进展强调了非编码RNA（ncRNAs）的关键作用，尤其是长链非编码RNA（lncRNAs）和环状RNA（circRNAs），其可调控R环动态，影响肿瘤发生并促进治疗耐药。这些ncRNAs参与R环的形成、稳定与解离，进而调节转录调控、DNA修复和染色质构象等关键过程。例如，circSMARCA5和circDMD等circRNAs已被证明可诱导R环形成，从而影响基因表达并提高癌细胞对化疗的敏感性。相反，TUG1和NEAT1等lncRNAs可调控R环解离，维持基因组稳定性并增强肿瘤细胞存活。ncRNAs与R环之间的相互作用为靶向治疗策略提供了有前景的切入点，这些策略旨在恢复R环平衡以改善癌症治疗结局。本综述深入探讨了ncRNAs调控R环动态的分子机制，并讨论了其作为肿瘤学中生物标志物和治疗靶点的潜力。此外，还强调了将这些发现转化为临床应用所面临的挑战与未来发展方向。

1. Introduction

本文以肿瘤学中基因表达调控机制为切入点，指出非编码RNA（ncRNAs）与R环已成为新兴关键调控因子。R环由RNA:DNA杂交体与被置换的单链DNA（ssDNA）构成，广泛存在于真核基因组中。在正常生理条件下，R环参与转录起始、延伸与终止，并影响染色质状态和DNA甲基化；而持续存在或失调的R环则会诱发DNA双链断裂、复制压力及染色体重排，进而推动肿瘤发生。文章强调，R环稳态受转录活性、DNA序列特征、超螺旋应力、RNA加工以及解旋酶活性共同塑造，而越来越多的ncRNAs通过直接碱基配对或调控RNA结合蛋白与染色质可及性影响R环形成、稳定和拆解。作者进一步指出，lncRNAs、circRNAs及miRNAs虽均属于重要调控RNA，但与R环关系最密切的是核内富集的lncRNAs和circRNAs。以乳腺癌中的circSMARCA5和卵巢癌中的PLADE为例，文章说明ncRNA介导的R环动态与肿瘤增殖、转移和耐药密切相关，从而提出ncRNA–R环轴可能成为癌症诊断与治疗的新靶点。

2. Biological characteristics of ncRNAs and R-loops

2.1. Classification and functions of ncRNAs

本节系统概述了ncRNAs的分类及功能。文章指出，高通量测序和生物信息学的发展改变了“非编码区只是转录噪音”的传统认知。ncRNAs大体可分为管家型与调控型两类：前者如rRNA、tRNA和snRNA，主要负责基础细胞活动；后者包括lncRNAs、circRNAs和miRNAs，构成复杂调控网络。作者将论述重点集中于lncRNAs和circRNAs，因为这两类RNA常定位于细胞核或染色质，参与染色质重塑、转录调控和RNA加工，与R环形成和稳定关系尤为密切。lncRNAs通常长度超过200 nt，由RNA聚合酶II（Pol II）转录，具有5′帽和3′ poly(A)尾，常表现为低丰度、低序列保守性和高组织特异性，其复杂二级结构赋予其多样化功能。它们可招募染色质修饰复合体、调控Pol II及转录因子活性，并在启动子、转录起始位点或复制起点附近通过结构化RNA结构域稳定或破坏RNA:DNA杂交体。circRNAs则由反向剪接（back-splicing）形成共价闭环结构，因抗外切酶降解而高度稳定。除经典的miRNA海绵作用外，circRNAs还可与DNA、Pol II及转录调节因子相互作用，通过形成RNA:DNA杂交体参与转录和剪接调控，部分circRNAs还可借助内部核糖体进入位点（IRESs）编码功能性肽。总体而言，作者认为lncRNAs和circRNAs凭借其与染色质修饰复合体、转录机器和RNA加工因子的相互作用，成为R环稳态的重要调节者。

2.2. Formation mechanism, detection techniques, influencing factors, and physiological functions of R-loops

2.2.1. Formation mechanism of R-loops

文章指出，R环是转录过程中形成的三链核酸结构，由RNA:DNA杂交体和单链DNA组成。全基因组研究表明，约5%的哺乳动物基因组可形成R环，且在转录起始位点（TSSs）、转录终止位点（TTSs）和高转录活性区域富集。在肿瘤相关层面，MYC、TERT、BRCA1、BRCA2和ATR等经典癌基因或抑癌基因的启动子或基因体区域可见R环富集，并与癌基因激活、DNA修复通路失衡及基因组不稳定性有关。依据RNA来源，R环可分为顺式R环和反式R环：顺式R环由新生RNA在Pol II后方回补模板DNA链形成；反式R环则由远端位点或外源来源RNA与互补DNA杂交形成，常由ncRNAs介导。作者强调，反式R环尽管频率较低，但通常对基因组稳定性危害更大，更易诱发转录–复制冲突和DNA损伤。

2.2.2. Detection techniques

本节总结了R环检测与定位的主流技术体系。DRIP-seq通过S9.6单克隆抗体富集RNA:DNA杂交体并结合测序实现全基因组识别，是应用最广的方法，但受限于特异性和分辨率。R-ChIP利用催化失活的RNase H1进行染色质免疫沉淀，具有更高特异性。ssDRIP-seq、MapR和CUT&Tag-R-loop等新方法则在链特异性、空间分辨率和定量准确性方面进一步提升，更适于研究药物处理或应激状态下R环的动态变化。免疫荧光（IF）和荧光原位杂交（FISH）则提供细胞或组织层面的空间分布信息。作者借此说明，R环生物学的快速发展高度依赖于检测技术的持续演进。

2.2.3. Physiological functions

文章认为，R环在正常生理中并非单纯有害结构，而是广泛参与基因表达调节。其可通过影响Pol II延伸导致转录暂停和回退，也可在转录终止位点促进终止过程。R环还通过表观遗传机制影响基因表达，例如排斥DNA甲基转移酶3B（DNMT3B）以维持启动子低甲基化，或与N⁶-甲基腺苷（m⁶A）修饰协同建立“m⁶A修饰→R环→DNA甲基化”调控轴。然而，当R环异常积累时，则会导致DNA双链断裂（DSBs）、复制叉停滞和染色体重排。文章特别指出，BRCA1缺陷乳腺癌细胞中活跃转录位点的R环累积可削弱DNA修复并提高突变率。此外，R环还参与肿瘤免疫微环境调控，可激活cGAS-STING通路、诱导I型干扰素表达，并增强抗PD-1免疫治疗反应。

2.2.4. Regulatory factors

本节聚焦R环形成与解离的决定因素。首先，富含鸟嘌呤的序列和G-四链体（G4）结构有利于RNA:DNA杂交形成，尤其在GC丰富的启动子、脆性位点与端粒区域显著。G4–R环耦联可稳定转录暂停、促进启动子激活和远程染色质互作，但其过度持续存在会引发复制压力和基因组不稳定。其次，多类蛋白和酶参与R环动态平衡，包括RNase H1/H2、SETX、DDX5、DDX21、DHX9、BLM、WRN、FANCJ及拓扑异构酶I/II等。RNA剪接因子、RNA结合蛋白以及SWI/SNF和FACT等染色质重塑复合体也可通过影响转录、RNA加工和染色质可及性间接调控R环。表观遗传层面，METTL3、FTO及YTHDC1/YTHDF2等m⁶A调控因子通过“writer–eraser–reader”轴调节R环形成和转录终止。作者在此提出，从序列和蛋白中心的传统视角出发，R环稳态已被较好解释，但新兴证据表明特定ncRNAs可主动决定R环发生位点和命运，提示存在另一层以RNA为中心的调控模式。

3. The key role of ncRNAs in R-loop formation and regulation

本部分指出，lncRNAs和circRNAs由于长度较长、核内定位及与基因组DNA较高互补性，能够直接参与R环形成与调控，因此成为研究R环动态的核心ncRNA类型。文章强调，许多ncRNA介导的R环属于反式R环，尽管发生频率低，但具有高度位点特异性和功能重要性，可影响基因表达、表观遗传状态和染色质结构。

3.1. ncRNA-induced R-loop formation

作者总结，部分lncRNAs和circRNAs可通过序列互补性直接与DNA杂交并诱导R环形成。典型例子包括lncRNA TARID在Tcf21启动子区域形成局部R环并招募TET1，实现DNA去甲基化与转录激活；circ-calm4在肺动脉平滑肌细胞中于COMP位点形成circRNA诱导R环（circR-loop），从而调控铁死亡通路。作者据此提出，lncRNAs和circRNAs可作为序列特异性的“地址编码”，将R环精准导向特定位点。但同时也指出，目前关于ncRNA诱导R环的证据仍集中于少数位点和模型体系，多依赖过表达或敲低联合S9.6或RNase H1检测，尚难完全排除染色质或转录改变带来的间接效应。

3.2. ncRNA in R-loop stabilization and resolution

除了诱导形成，ncRNAs还参与R环稳定与清除。文章指出，一些lncRNAs可通过招募R环结合蛋白形成保护复合体，避免RNA:DNA杂交体被解旋酶或核酸酶清除，如ANRASSF1在RASSF1A启动子形成稳定R环并招募多梳抑制复合体2（PRC2）维持沉默。另一方面，ncRNAs还可调控DDX5、SETX、RNase H1等R环清除酶的活性和定位，从而促进特异性R环解离。NORAD通过与PUMILIO蛋白相互作用影响DNA修复通路中的R环累积，也被视为间接维持基因组稳定的重要例证。作者据此将ncRNAs概括为既可充当R环的“构筑者”，也可担任有害杂交体的“监督者”，二者角色取决于细胞状态与应激背景。

4. Molecular mechanisms of ncRNA-mediated R-loop regulation and their roles in cancer

4.1. Direct induction of R-loop formation by ncRNAs to regulate the expression of tumor-associated genes

本节聚焦癌症中ncRNA直接诱导R环形成并调控肿瘤相关基因表达的机制。circSMARCA5在乳腺癌中与宿主基因SMARCA5 DNA结合，于外显子15附近诱导R环，导致Pol II暂停，抑制全长SMARCA5 mRNA生成并促进无功能异构体ΔSMARCA5产生，进而削弱DNA损伤修复并提高对顺铂和博来霉素的敏感性。宫颈癌中，炎症因子TNF-α可诱导circDMD上调，后者在VEGFR3启动子形成R环并增强其转录活化，从而促进血管生成、转移和肿瘤适应性。鼻咽癌中，超级增强子来源lncRNA seRNA-NPCM在NDRG1启动子形成R环，并与hnRNPR协同稳定增强子–启动子环化，进一步上调TRIB1等致癌基因。急性髓系白血病中，HOTTIP在CCCTC结合因子（CTCF）结合位点诱导R环形成，增强CTCF锚定并维持拓扑相关结构域（TADs）边界完整性，同时招募cohesin复合体促进远程增强子–启动子互作，激活β-catenin（CTNNB1）等癌基因。整体来看，本节强调ncRNAs可借助R环在特定基因组环境下实现对转录与染色质拓扑的精确调控。

4.2. Regulation of R-loop resolution by ncRNAs to maintain genomic stability in cancer

本节强调ncRNAs通过促进或抑制R环解离来影响肿瘤细胞基因组稳定性及药物敏感性。结直肠癌中，p53诱导circASCC3表达，circASCC3通过结合并保护RNA解旋酶DDX5免受蛋白酶体降解，增强R环清除、减轻DNA损伤并提高化疗耐受。复制压力条件下，lncRNA TUG1迅速上调并富集于核内R环焦点，通过与复制蛋白A（RPA）复合体及DHX9相互作用搭建R环解离平台；TUG1缺失则引起R环积累、γ-H2AX升高、DNA双链断裂和细胞周期阻滞。多发性骨髓瘤中，NEAT1通过与转录辅因子AATF/Che-1在核旁斑（paraspeckles）中共定位，促进特定位点R环及时清除，缺失Che-1可引发R环积累和干扰素通路过度激活。卵巢癌中，腹水外泌体来源lncRNA PLADE结合HNRNPD并促进其VHL依赖性泛素化降解，抑制R环清除，增强DNA损伤信号并提高肿瘤细胞对铂类药物的敏感性。该节表明，ncRNA对R环清除蛋白的表达、稳定性和定位调控，是影响癌细胞命运与治疗反应的重要机制。

4.3. Roles of m⁶A-modified ncRNAs in R-loop regulation in cancer

作者进一步讨论m⁶A修饰如何赋予ncRNA调节R环的新层级。胶质瘤中，m⁶A修饰的circPOLR2B可与宿主基因POLR2B形成R环，抑制其转录；m⁶A读取蛋白YTHDC1促进circPOLR2B核输出，减少核内circPOLR2B及其介导的R环，从而解除对POLR2B的抑制，并通过PBX1激活NES和SOX2，增强胶质瘤干细胞（GSCs）干性。端粒层面，端粒重复序列RNA TERRA在METTL3介导m⁶A修饰后，借助YTHDC1或hnRNPA2B1获得稳定性与端粒募集能力，从而增强端粒R环形成并促进RAD51介导的同源重组。该机制在替代性端粒延长（ALT）阳性神经母细胞瘤中尤为关键，METTL3抑制可导致R环丢失、端粒损伤增加及ALT通路受抑。作者认为，m⁶A可能通过改变ncRNA结构、稳定性、核滞留或蛋白招募能力来调控R环，但直接分子机制仍待厘清。

4.4. Stabilization of R-loops by ncRNAs to preserve chromatin architecture and telomere integrity in cancer

本节主要围绕TERRA在端粒稳态中的作用。ALT依赖型肿瘤中，TERRA通过与赖氨酸特异性去甲基化酶1A（LSD1）结合，促进其在端粒区域富集并形成相分离凝聚体，作为支架招募Rad51AP1等R环调控因子，从而稳定端粒R环。LSD1在此处并非依赖其经典去甲基化活性，而是作为RNA结合的结构组织者发挥作用。与此同时，TERRA还可通过UUAGGG重复序列与短端粒形成特异性RNA:DNA杂交，该过程依赖RAD51及BRCA2。TERRA与RAD51AP1的协同还促进端粒区域R环与G4结构共存，并激活断裂诱导复制（BIR）通路以支持ALT活性。作者据此指出，TERRA不仅是R环模板，更是构建高阶核酸–蛋白复合体、维持端粒完整性与癌细胞增殖能力的核心因子。

4.5. Indirect regulation of R-loops by ncRNAs under disrupted cellular homeostasis in cancer

文章最后总结了一类间接调控机制，即某些ncRNAs并不直接构成R环，而是通过改变细胞稳态环境影响R环形成和清除。BRCA1可通过结合TERRA并抑制其转录、促进其降解来限制端粒R环积累；BRCA1缺陷则导致TERRA过表达、R环积累和端粒复制压力。外显子circRNAs（ecircRNAs）正常情况下由Exportin 4（XPO4）输出至胞质，XPO4缺失则引起其核内滞留，形成circRNA:DNA杂交体（ciR-loops）并诱导DNA损伤，DDX39A/B可缓解这一过程。前列腺癌中，miR-346通过破坏NORAD–PUM2相互作用削弱DNA修复相关mRNA稳定性，同时直接结合染色质启动转录并促进R环形成，最终提高复制压力和DNA损伤；相反，NORAD可通过靶向诱导miRNA降解维持基因组完整性。另有研究指出，SPT6缺失导致H3K36me³异常分布和lncRNAs广泛异常转录，这些未加工lncRNAs结合染色质并促进R环形成，加剧复制–转录冲突。该节表明，ncRNA不仅是R环结构调控因子，也是塑造R环病理环境的重要上游变量。

5. Potential of ncRNAs and R-loops in tumor diagnosis and therapy

本文指出，R环失衡与KRAS、TP53突变、肿瘤分期、转移潜能及患者生存显著相关，且低R环评分常伴随T细胞耗竭表型。R环积累还可通过激活cGAS-STING等先天免疫通路影响肿瘤免疫逃逸和治疗反应。耐药方面，PARP1上调可促进R环清除并介导拓扑异构酶I抑制剂耐药，而SYCP2等因子异常表达则增强R环相关DNA修复通路。作为R环调控网络关键成分，ncRNAs正成为潜在治疗靶点。文章列举了circRNA_0000392作为结直肠癌早筛与复发风险评估标志物的应用前景，以及针对HOTAIR、MALAT1等致癌lncRNAs的反义寡核苷酸和siRNAs在临床前研究中的进展。circRNA药物方面，RXRG001已进入临床试验，显示出circRNA治疗转化的可行性。作者认为，单细胞多组学、CRISPR筛选及人工智能辅助药物设计将推动ncRNA–R环互作图谱解析和精准干预策略建立。

6. Conclusions and future perspectives

结论部分系统总结了ncRNAs通过调控R环形成、稳定和解离，在转录调控、端粒维护、DNA修复与表观遗传调节中发挥中心作用，并深度参与肿瘤起始、进展和治疗应答。作者强调，lncRNAs和circRNAs在不同癌种中的功能异质性，为肿瘤分型和个体化治疗提供了分子基础。与此同时，ncRNA–R环研究也已扩展至肺动脉高压、糖尿病创伤修复障碍及神经退行性疾病等非肿瘤领域，提示其广泛病理适应性。文章最后指出，当前仍面临若干关键挑战，包括R环检测技术在分辨率、动态灵敏度和低输入样本适用性方面的不足，ncRNA转录复杂性及可变剪接对因果解析的干扰，以及缺乏区分“功能性”与“病理性”R环的明确标志物。未来若能整合临床大规模多组学数据、长期随访和机制研究，有望建立ncRNA–R环特征谱用于早期诊断、预后判断和疗效预测，并开发靶向病理性R环或关键ncRNAs的小分子、反义寡核苷酸和基因编辑策略，最终推动该调控轴向精准肿瘤医学转化。