携带blaNDM-1并致新生儿脓毒症肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)中毒力决定因子与致病力减弱并存现象的研究

《Virulence》：Genetic determinants of hypervirulence with attenuated pathogenicity in a blaNDM-1-encoding Klebsiella pneumoniae causing neonatal sepsis

　　

摘要：研究人员从脓毒症新生儿中分离出一株此前未被认知的高毒力(hypervirulent, hvKp)血清型K39肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，评估了其高毒力决定因子的获得情况及毒力潜能。研究检测了质粒可转移性、毒力决定因子的功能表达、荚膜可视化(透射电镜,TEM)、比较基因组分析及毒力潜能(体外、体内实验)。该碳青霉烯耐药ST985-K39 K. pneumoniae(命名为Sil80)的高毒力质粒IncFIB(K)/IncHI1B(pNDM-MAR)携带rmpA、rmpA2、iucA、iroB、peg-344基因；blaNDM-1位于IncFIB(pQIL)/IncFII(K)质粒，其他抗菌药物耐药决定因子位于IncFII质粒。全球K39分离株的比较基因组分析首次揭示研究分离株获得了高毒力质粒。携带blaNDM-1的IncFIB(pQil)/IncFII(K)质粒可独立成功接合转移；而高毒力质粒[IncFIB(K)/IncHI1B(pNDM-MAR)]无法单独传递，但因nic位点相似性可随IncFII质粒共转移。该菌株具血清抵抗性并产生强生物膜。尽管具备高毒力决定因子，Sil80拉丝试验(string test)阴性、荚膜薄且在成年小鼠中毒力减弱。观察到RmpD蛋白C端缺失10个氨基酸，以及rmpADC启动子含10T poly T-track(P10T)突变。Sil80中rmpA、rmpD及rmpC表达亦下调。Sil80的rmpADC启动子突变及RmpD截短导致成年小鼠毒力减弱，但该分离株仍可在免疫低下新生儿中引起脓毒症。非自主接合毒力质粒的转移由具相似nic位点的辅助(helper)质粒协助完成，此现象可能促进此类质粒向迄今未知血清型的传播。

论文解读：携带bla_NDM-1致新生儿脓毒症肺炎克雷伯菌中毒力决定因子与致病力减弱并存现象的研究

本研究发表于《Virulence》。目前高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae, hvKp)多报道于K1、K2等经典血清型，且bla_NDM-1介导的碳青霉烯耐药hvKp（CR-hvKp）的出现带来严峻治疗挑战。然而，hvKp的定义不断演变，某些携带经典毒力标志物（如rmpA、iucA）的非经典血清型或存在毒力调控元件突变的菌株并不表现典型高毒表型。K39血清型此前未被关联hvKp，且毒力基因的存在并不等同于高毒力表型，rmpADC操纵子启动子poly T-track长度变化及rmpD完整性对表型的影响尚需阐明。本研究从新生儿脓毒症血液中分离得到ST985-K39型碳青霉烯耐药K. pneumoniae Sil80，其质粒携带全套hvKp标志基因却在成年小鼠中无毒力，研究人员旨在解析其毒力衰减的分子机制、质粒传播特征及非常规hvKp谱系的基因组特点，以深化对hvKp判定标准的认识。

主要关键技术方法

研究人员收集2020年印度西尔恰尔医学院NICU脓毒症新生儿血培养阳性肺炎克雷伯菌分离株，筛选获得Sil80。采用VITEK 2进行菌种鉴定与药敏试验（CLSI标准），PCR筛查毒力（rmpA、rmpA2、iucA、iroB、peg-344等）与耐药基因（bla_NDM-1等）。进行固/液接合传递实验（供体Sil80 × 叠氮钠抗性E. coli J53受体），以不同抗生素/碲酸钾筛选转接合子(transconjugant)。全基因组二代(Illumina NovaSeq 6000)联合三代(Oxford Nanopore PromethION)测序，Unicycler混合组装，通过Pathogenwatch、VFDB、ResFinder、PlasmidFinder、OriTfinder注释序列型(ST)、K血清型、毒力/耐药基因、质粒复制子及oriT位点；与全球49株ST985-K39分离株做核心基因组SNP系统发育分析(CSI Phylogeny)及毒力/耐药基因热图比对。体外检测包括拉丝试验(string test)、粘液粘度测定、结晶紫法生物膜形成定量、人血清杀菌试验；透射电镜(TEM)观察荚膜厚度；qRT-PCR检测rmpADC操纵子(rmpA、rmpD、rmpC)相对表达量（以野生型P_11TK1/K2/K57 hvKp为参照）。体内毒力采用成年雌性BALB/c小鼠腹腔注射感染模型，监测7天生存曲线(Kaplan–Meier + Log rank检验)。通过ClustalW多序列比对、AlphaFold2蛋白结构预测比较RmpD截短及ManC(F199L)突变影响。

研究结果

Genome analysis of carbapenem-resistant hvKp（碳青霉烯耐药hvKp基因组分析）

混合组装得到染色体(5.31 Mb)及三质粒：pV₂₀₂₁（IncHI1B(pNDM-MAR)/IncFIB(K)，~218 kb，含rmpA、rmpA2、iucA、iroB、peg-344及碲酸钾抗性terABCDW）、pR_2021.1（IncFIB(pQil)/IncFII(K)，含bla_NDM-1、bla_DHA-1、bla_TEM-12、rmtC、qnrB1等）、pR_2021.2（IncFII，含bla_TEM-1、bla_SFO-1、rmtB）。染色体携带ICEKp12（耶尔森菌素ybt）、iutA、iroEN、I/III型菌毛及T4SS/T6SS。结论：Sil80为ST985-K39碳青霉烯耐药株，毒力质粒与经典pLVPK/pK2044同源性>97%。

Phylogenetic analysis with global ST985-K39 isolates（与全球ST985-K39分离株的系统发育分析）

核心基因组SNP分析显示Sil80与全球49株ST985-K39相似度99.10%–99.60%；29%全球K39-ST985携带碳青霉烯酶基因，但仅Sil80携带pLVPK样高毒力质粒。结论：此为首次在K39血清型中发现hvKp毒力质粒的获得。

Transmissibility of resistance and virulence plasmids（耐药与毒力质粒的可传递性）

pR_2021.1(bla_NDM-1)可独立接合转移至TC-NDM；pV₂₀₂₁单独选择碲酸钾无转接合子；因pV₂₀₂₁与pR_2021.2具相同10 bp nic位点且pV₂₀₂₁缺失松弛酶(relaxase)，选用阿米卡星+碲酸钾成功筛选到共转移pV₂₀₂₁+pR_2021.2的TC-VIR。结论：非自主接合毒力质粒pV₂₀₂₁借助含相似nic位点辅助质粒pR_2021.2实现共转移。

Virulence potential of Sil80（Sil80毒力潜能）

I) in vitro virulence potential（体外毒力潜能）：拉丝试验阴性（拉丝<5 mm），粘滞度OD₆₀₀比值为0.01±0.002（非高粘液型）；生物膜OD₅₉₅=1.185±0.04显著高于经典cKp ATCC700603(0.468±0.04, p<0.05)；人血清孵育3 h存活率100%（血清抵抗，与hvKp SB42相当）。结论：虽携毒力基因但无高粘液表型，具强生物膜形成及血清抵抗能力。

Ii) in vivo virulence potential（体内毒力潜能）：成年BALB/c小鼠腹腔感染2×10⁵CFU无死亡（同ATCC700603），对照hvKp SB42组2天内100%死亡(p<0.05)。结论：Sil80在免疫健全成年小鼠中致病力减弱。

Imaging of bacterial capsule through TEM（透射电镜荚膜成像）

TEM测得以超薄切片测荚膜厚度：经典cKp EN5219为18.79 nm，Sil80为45 nm，hvKp SB42为182.21 nm。结论：Sil80荚膜显著薄于典型hvKp，与其拉丝试验阴性相符。

Comparison of pV₂₀₂₁with the canonical hypervirulent plasmids（pV₂₀₂₁与经典高毒性质粒比较）

pV₂₀₂₁与pLVPK/pK2044高度同源；iroN因IS5家族插入失活但染色体有功能性iroN补偿；rmpD发生C端10个氨基酸缺失（截短RmpD），AlphaFold2提示该功能域缺失可能影响RmpD与Wzc互作致功能丧失；rmpADC操纵子启动子区poly T-track为10T(P_10T)，不同于经典P_11T。结论：RmpD截短及P_10T弱启动子可能是高粘液表型缺失主因。

Mutation analysis of capsular polysaccharide synthesis region（荚膜多糖合成区突变分析）

cps基因簇存在多处点突变（galF、wzc等K39谱系共有突变及ManC F199L特有突变），AlphaFold2显示ManC F199L未引起明显构象改变。结论：cps区共有突变不决定表型差异，ManC突变未破坏整体结构但不排除动力学影响。

Expression analysis of structural genes of rmpADC cascade（rmpADC操纵子结构基因表达分析）

qRT-PCR显示Sil80中rmpA、rmpD、rmpC相对野生型P_11TK1/K2/K57 hvKp均显著下调（如vs K1：rmpA ?70.03倍，rmpD ?14.39倍，rmpC ?91.79倍）。结论：P_10T启动子致rmpADC操纵子整体转录水平降低。

讨论与结论

研究人员讨论指出，Sil80是首例获pLVPK样毒力质粒的ST985-K39 CR-Kp，其毒力质粒依靠nic位点相同辅助质粒共转移，提示非常规血清型可通过辅助质粒获得毒力/耐药共传播风险。尽管携带全套毒力标志，Sil80因rmpADC启动子poly T-track缩短为P_10T（弱启动子）致rmpA/rmpD/rmpC表达下调，加之rmpD C端10 aa缺失削弱其与Wzc作用影响荚膜延长，以及可能的ManC(F199L)微效影响，共同导致薄荚膜、拉丝试验阴性及成年小鼠无毒力表型；但菌株保有血清抵抗与强生物膜形成能力，可在免疫低下新生儿中引发脓毒症。研究表明仅凭毒力基因存在不足以判定hvKp，须结合启动子状态与rmpD完整性评估。最终结论：碳青霉烯耐药ST985-K39 K. pneumoniae Sil80同时具备高毒力遗传决定因子与表型减弱特征，其毒力衰减归因于rmpADC启动子P_10T突变及rmpD截短；非自主接合高毒力质粒可经nic位点匹配辅助质粒共转移，促进毒力/耐药在不同血清型中扩散；判定hvKp应综合毒力基因、调控序列完整性及表型特征。