生物源三元CuO–AgO–MgO纳米复合材料对耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌临床分离株的抗菌与抗生物膜活性评价

《Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology》：Antibacterial and antibiofilm evaluation of biogenic ternary CuO–AgO–MgO nanocomposite against clinical isolates of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

　　

抗菌药物耐药性在肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae, K. pneumoniae）中的不断升级已成为全球瞩目的公共卫生问题。本研究报告了利用香蕉皮提取物作为安全可持续的还原剂和稳定剂，绿色生物合成铜、银、镁氧化物三元金属纳米复合材料（CuO–AgO–MgO TNCs），并强调其对耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant K. pneumoniae, CRKP）菌株的抑制活性。研究人员采用紫外–可见（ultraviolet–visible, UV–vis）光谱、傅里叶变换红外（Fourier transform infra-red, FTIR）光谱、X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）分析、透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）、扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）及能量色散X射线（energy-dispersive X-ray, EDX）分析对该TNCs进行表征，确认其晶体结构（平均粒径125 nm）及元素组成（Cu、Ag、Mg、O）。采用WI-38正常细胞进行细胞毒性评估，结果显示最小毒性效应，半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC₅₀）为193.49 ± 2.85 μg/mL。抗菌活性评价针对基因型多样的CRKP菌株展开，琼脂孔扩散试验（well diffusion assay, WDA）显示抑菌圈直径为18–38 mm，而微量肉汤稀释法（broth microdilution assay）测得最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）和最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）分别介于8–1024 μg/mL和128–2048 μg/mL。时间杀伤试验（time-kill assay）表明2小时内细菌生长显著减少，抗生物膜试验显示对生物膜形成的抑制率为25–91%。SEM图像揭示了处理后细菌细胞明显的形态学改变。研究结果表明，生物源CuO–AgO–MgO TNCs对CRKP具有强效的抗菌和抗生物膜活性，同时对正常细胞毒性可忽略，凸显其作为安全有效替代抗菌策略的潜力。

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae, K. pneumoniae）作为机会性致病菌，因其广泛流行病学、临床影响及日益加剧的抗菌药物耐药性，已成为全球瞩目的公共卫生问题。该菌可严重侵袭人体多个部位，包括血液、肺、肝脏、手术部位或创面、泌尿道及脑部。尤为值得关注的是，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant K. pneumoniae, CRKP）可引起广泛的医院获得性感染，导致发病率和死亡率升高，尤其在肿瘤疾病患者中。世界卫生组织（World Health Organization, WHO）将CRKP列为最高优先级病原体之一，其全球感染相关死亡率约为40%–50%。传统预防多重耐药（multi-drug resistant, MDR）细菌感染策略包括去定植、感染患者隔离及表型与基因型监测，但面对CRKP的快速传播，开发替代性抗菌策略迫在眉睫。

纳米技术为应对MDR病原体提供了有前景的解决方案。纳米颗粒（把握好其微小尺寸、高比表面积及增强的反应活性，表现出优异的生物屏障穿透能力和微生物细胞选择性。近年来，由三种金属组成的三元金属纳米复合材料（trimetallic nanocomposites, TNCs）因其各组分的协同增效作用而备受关注，其活性机制涉及膜破坏、活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成及持续释放干扰细菌代谢的金属离子等。其中氧化镁（MgO）可改善生物相容性和结构稳定性，而氧化铜（CuO）和氧化银（AgO）则对革兰氏阴性病原体具有强效杀菌作用。然而，传统NPs制备方法存在成本高、步骤繁琐、需使用有毒试剂等缺陷，促使绿色纳米技术理念兴起。植物来源的生物还原法因其操作简便、经济安全、适于规模化生产等优势，成为生物源NPs合成的重要途径。

该研究发表于《Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology》，旨在利用香蕉皮提取物绿色合成CuO–AgO–MgO TNCs，系统评价其对基因型多样CRKP临床分离株在浮游态和生物膜态下的抑制潜力及细胞毒性，以期为开发安全有效的抗CRKP新型纳米抗菌剂提供实验依据。

研究人员开展该项研究用到的主要关键技术方法包括：采用BOXA1–PCR技术对34株基因型多样的CRKP临床分离株（来源于此前已表征的菌株库，经确认携带bla_OXA-48、bla_NDM和bla_KPC等碳青霉烯酶编码基因）进行基因分型及系统发育分析；以香蕉皮提取物为还原剂和稳定剂绿色生物合成CuO–AgO–MgO TNCs；运用UV–vis、FTIR、TEM、SEM、EDX、XRD、动态光散射（dynamic light scattering, DLS）及zeta电位分析等技术对TNCs进行全面表征；采用MTT法检测TNCs对WI-38正常细胞的细胞毒性；通过WDA和微量肉汤稀释法测定MIC及MBC并计算活性指数（activity index, AI）、抑制百分率（percent inhibition, PI）和治疗指数（therapeutic index, TI）；实施时间杀伤试验评价杀菌动力学；采用结晶紫染色法进行抗生物膜试验；利用SEM观察TNCs处理后细菌形态学改变。

**BOXA1–PCR基因分型与系统发育分析**：研究人员对34株CRKP临床分离株进行BOXA1–PCR分析，获得34种不同的DNA指纹图谱，将其命名为B1–B34共34个独特基因型。基于50%相似性截断值，这些菌株可分为6个BOX簇（BC1–BC6）和5个BOX单型（BS1–BS5）。其中BC5簇包含7株（20.6%）最为常见，BC1和BC4各含6株（17.6%）。各电泳泳道条带数为2–12条，分子量范围约200 bp至3 kbp。Simpson多样性指数（Simpson's index of diversity, D）为1，表明BOXA1–PCR对CRKP菌株具有理想的鉴别能力。该结果揭示了研究菌株间高度的遗传异质性，为后续评价TNCs对不同基因型CRKP的抗菌活性奠定了流行病学基础。

**生物源TNCs的表征**：UV–vis光谱显示TNCs在约300 nm和430 nm处有两个主要吸收带，前者归因于CuO和MgO的电子跃迁及电荷转移过程，后者源于纳米复合材料中的氧化银结构域。FTIR光谱在3281、3239、3173、2176、1627、1432、813、661、599、519和418 cm^?1处观察到特征吸收峰，对应香蕉皮提取物中多糖、胺类、氨基酸、酚类和蛋白质等生物活性分子的官能团，其中400–800 cm^?1区域的强峰归属于纳米复合材料的金属–氧键。TEM图像显示TNCs呈不规则形或纳米片形态，粒径范围85–140 nm，平均粒径约120 nm；SEM分析揭示其表面为多孔不均一晶体结构。EDX检测证实TNCs由Cu、Ag、Mg、O元素组成，其重量百分比分别为Cu 22.6%、Mg 14.5%、Ag 16.2%、O 42.8%，另含少量源自植物源生物分子的C、N、K元素。XRD分析在2θ为27.5°、32.2°、36.8°、38.8°、42.7°、46.2°、48.9°、54.8°、57.3°、62.2°、68.02°和74.5°处显示多个清晰衍射峰，与AgO（JCPDS: 84-1108）、MgO（JCPDS: 9000493）和CuO（JCPDS: 0481548）标准图谱吻合，证实了三元金属氧化物的共存及材料的晶体性质；采用Scherrer方程计算平均晶粒尺寸约123 nm。DLS测得平均水动力粒径约175 nm，大于电镜结果，归因于水合层及表面结合生物分子的影响；多分散指数（polydispersity index, PDI）为0.294，表明中等程度的多分散性。Zeta电位分析测得数值为?35.8 mV，分布主峰位于?31.3 mV（占比65.8%），多峰特征提示表面植物化学物质的异质性吸附，但整体负电荷保证了良好的胶体稳定性。

**TNCs的细胞毒性**：采用WI-38正常细胞系进行MTT法检测，结果显示TNCs在250、125、62.5、31.25、15.62和7.81 μg/mL浓度下的细胞存活率分别为27.28%、78.40%、99.0%、99.3%、99.4%和99.45%，IC₅₀为193.49 ± 2.85 μg/mL。鉴于IC₅₀ ≥ 90 μg/mL即视为无细胞毒性，该结果表明绿色合成的CuO–AgO–MgO TNCs具有良好的生物安全性，为其后续抗菌应用提供了安全性依据。

**TNCs对CRKP的抗菌活性**：WDA定性试验显示，TNCs（100 μg/mL）对34株CRKP的抑菌圈直径（inhibition zone diameter, IZD）为18–38 mm，抑制百分率达64.3%–168.4%，其活性高于10倍浓度的各前体金属盐（AgNO₃、Cu(NO₃)₂·3H₂O、Mg(NO₃)₂·6H₂O，均为1000 μg/mL），表明三元结构的协同增效作用。微量肉汤稀释法测得MIC为8–1024 μg/mL，MBC为128–2048 μg/mL。MIC指数（MICi = MBC/MIC）为1–16，显示TNCs对不同菌株呈现可变的杀菌或抑菌效应。治疗指数（TI = TNCs的IC₅₀/MIC）范围为0.19–24.2，高TI值（对应低MIC，8–64 μg/mL）提示TNCs具有良好的抗菌选择性和生物安全性。基因型分析初步提示，具有较宽条带图谱（达12条）的BC5和BC6簇菌株倾向于表现出较高MIC值，而条带较少的BC3簇菌株MIC相对较低，但由于菌株遗传异质性显著且簇内样本量有限，基因型与表型反应之间未检测到统计学显著相关性。

**时间杀伤试验**：针对代表性CRKP临床分离株的时间杀伤曲线显示，在0.5 MIC、MIC和2 MIC浓度下，TNCs处理组细菌生长均在2小时内出现快速初始减少，分别于6小时、8小时和/或24小时达到完全生长抑制。该结果表明TNCs在低浓度下即可快速抑制并杀灭CRKP细菌细胞，具有良好的杀菌动力学特征。根据标准判定，6小时内实现90%或24小时内实现99.9%的致死率即表明具有杀菌活性。

**生物膜形成抑制试验**：结晶紫微量板法评价显示，TNCs（0.5 MIC）对34株CRKP生物膜形成的抑制率为25.31 ± 0.28%至90.72 ± 1.52%，表明TNCs能够通过抗黏附作用阻断生物膜形成的初始步骤，从而有效抑制细菌生物膜。

**扫描电子显微镜观察**：SEM图像清晰揭示了TNCs处理导致的细菌细胞形态学改变。未处理对照组CRKP细胞表面光滑、形态完整；而TNCs暴露组细胞表面附着大量纳米颗粒，出现多处划痕，细胞变形、体积缩小呈轻度球状，特征性细胞膜结构丧失，最终发生剧烈破坏和裂解。这些膜破裂、表面塌陷和细胞收缩现象表明TNCs对细菌细胞包膜造成直接物理损伤，这种结构性破坏可能促进纳米复合材料向细胞内渗透，从而增强其抗菌效能。

讨论部分中，研究人员将本研究与前人工作进行了充分比较。在基因分型方面，研究结果与Lagha等关于K. pneumoniae临床分离株BOXA1–PCR分子分型结果相符，后者在80%截断值下获得18个簇，鉴别指数为0.97。在纳米复合材料生物合成方面，植物提取物法相较于微生物合成法具有实验室要求低、适于商业化、无有害化学品、步骤快速简便、安全性高及纳米粒子稳定性好等优势。与单金属及双金属纳米材料相比，三元金属纳米复合材料的协同效应和改良理化性质使其抗菌活性显著增强。本研究合成的CuO–AgO–MgO TNCs在MIC范围、抗生物膜效能方面优于或相当于已报道的Ag–Cu–ZnO、Ag–Cu–MgO等化学合成三元体系，且采用绿色合成路线更具安全性优势。研究人员也讨论了高TI和低TI情形下TNCs的不同应用前景：高TI情形（低MIC，TI > 3）适用于靶向或系统性给药；低TI情形（高MIC，TI < 1）更适合局部应用，如创面敷料功能化或医疗器械（如导管）抗菌涂层。此外，TNCs与传统抗生素联用可能降低所需剂量、提高有效TI。研究人员同时指出，MIC值的变异性及杀菌/抑菌模式差异可能反映了BOXA1–PCR揭示的基因组异质性对菌膜组成、外排泵表达、生物膜形成能力和代谢活性等表型特征的影响。

**研究结论**：本研究介绍了一种利用香蕉皮提取物作为天然还原剂和稳定剂、合成CuO–AgO–MgO三元纳米复合材料的新型可持续方法。生物合成的TNCs经结构和形态表征，TEM测得平均粒径120 nm，DLS测得175 nm。BOXA1–PCR分析显示所检分离株具有高度遗传多样性，且抗菌反应（如MIC、MBC和生物膜抑制）存在显著变异。TNCs还表现出实质性抗生物膜活性，抑制率为25.31 ± 0.28%至90.72 ± 1.52%。然而，由于分离株的高度异质性及各遗传簇内菌株数量有限，未能发现基因型分组与表型反应之间存在统计学显著相关性，因此观察到的差异应理解为描述性模式而非经证实的基因型–表型关系。该合成纳米复合材料显示出有前景的抗菌功效、快速杀伤动力学和阻止生物膜发展的能力，同时对健康细胞损伤小，并减少了单个组分所需浓度。研究强调了三元金属配方在应对多重耐药性方面的重要性，特别是在浮游态和生物膜态两方面。

未来研究需采用更大、统计学平衡的分离株集合、临床相关比较抗菌药以及复杂生物膜根除试验（如最小生物膜根除浓度，minimum biofilm eradication concentration, MBEC）来确认临床适用性并阐明细菌基因型与治疗反应之间可能存在的关联。此外，后续研究将纳入膜完整性试验、ROS定量、电感耦合等离子体发射光谱（inductively coupled plasma optical emission spectrometry, ICP-OES）离子释放谱及X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy, XPS）表面表征，以建立全面的因果机制框架。同时，未来工作将以临床抗CRKP药物（如黏菌素、替加环素或头孢他啶–阿维巴坦）作为MIC比较对照，并将评价扩展至其他细菌和真菌物种，以及动物感染模型，以评估更广泛适用性。最后，溶血试验和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放试验也将在未来研究中被考虑，以提供膜完整性和血液相容性的补充信息，从而获得更多维度的安全性评价。