叶酸受体靶向的PEGylated PLGA纳米颗粒用于上皮性卵巢癌中橙皮苷的部位特异性递送

《Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology》：Folate receptor-targeted PEGylated PLGA nanoparticles for the site-specific delivery of hesperidin in epithelial ovarian cancer

　　

橙皮苷（Hesperidin, HSP）是一种多酚化合物，广泛用于上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer, EOC）的治疗。然而，由于首过代谢、低溶解度和较差的肿瘤特异性导致的低生物利用度，阻碍了其临床有效性。因此，研究人员合成了载有橙皮苷的叶酸-PEGylated聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA）纳米颗粒（HSP-PEGylated PLGA FA NPs），以改善HSP的溶解度和靶向特异性，用于EOC的治疗。这些NPs通过纳米沉淀法合成，并评估了包封效率、粒径、扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）、差示扫描量热法（differential scanning calorimetry, DSC）、粉末X射线衍射（powder X-ray diffractometry, PXRD）和体外溶出。此外，在叶酸受体过表达的SKOV3细胞系上进行了抗氧化测定、细胞毒性、细胞摄取和流式细胞术。物理化学表征支持形成了HSP-PEGylated PLGA FA NPs，包封效率约89.34%，粒径约205 nm，zeta电位约-25 mV，证明了其物理稳定性。与pH 7.4相比，在pH 5.5下，NPs增强了HSP的释放。与针对FA受体过表达的EOC细胞系的HSP-PEGylated PLGA NPs（约32%）相比，这些NPs表现出更大的细胞毒性，IC₅₀值约29 μM/mL，并增强了早期凋亡（约44%）。所开发的制剂显示出作为靶向NP系统用于EOC治疗的前景。

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer, EOC）是女性生殖系统最致命的恶性肿瘤之一，其发病率高、诊断滞后且易产生化疗耐药。传统治疗（手术、放疗、化疗）因肿瘤微环境（tumour microenvironment, TME）改变和缺乏靶向性而疗效受限。植物源多酚橙皮苷（Hesperidin, HSP）具有抗氧化、抗炎和抗癌活性，但因其水溶性差、首过代谢强和肿瘤特异性低，导致生物利用度不足，临床效果受限。此前虽有研究尝试纳米载体包裹HSP，但多未进行聚合物功能化或靶向配体修饰，抗EOC活性有限。为此，研究人员设计并合成了叶酸（folic acid, FA）功能化的PEGylated PLGA纳米颗粒（NPs），以实现HSP在EOC中的部位特异性递送，提高溶解性和靶向能力。该论文发表在《Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology》。

为开展研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：（1）化学合成：通过EDC/NHS活化PLGA，与PEG二胺反应合成PEGylated PLGA共聚物（PLGA-PEG-NH₂），再经DCC/NHS活化FA后与PEGylated PLGA偶联，得到FA功能化共聚物（PEGylated PLGA-FA）。（2）纳米沉淀法制备载HSP的NPs：将HSP与共聚物共溶于丙酮，滴入含Poloxamer 407的水相中，搅拌挥发有机溶剂后离心、冻干，得到HSP-PEGylated PLGA NPs和HSP-PEGylated PLGA FA NPs。（3）表征方法：利用¹H NMR和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）确认共聚物结构；动态光散射（DLS）测定粒径与zeta电位；SEM观察形态；DSC和PXRD分析药物晶态转变；紫外-可见分光光度法测定包封效率与体外溶出。（4）细胞实验：选用人卵巢癌SKOV3细胞系（叶酸受体过表达），进行MTT细胞毒性试验、共聚焦显微镜定性药物摄取和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术定量凋亡。样本队列来源为美国模式培养物集存库（ATCC）和国家细胞科学中心（NCCS, Pune, India）。

结果部分：

**Characterization of PEGylated PLGA and PEGylated PLGA-FA copolymer by ¹H NMR**：通过¹H NMR谱图确认了PEGylated PLGA共聚物中酰胺键（δ 7.4–7.8 ppm）的形成，以及FA功能化后出现蝶啶质子（δ 8.7 ppm）和芳香质子（δ 6.9 ppm），证实了共聚物的成功合成与功能化。

**Characterization by FT-IR**：FT-IR谱图显示PEGylated PLGA中出现了酰胺键（3385 cm^?1），FA功能化后出现苯环吸收（1749 cm^?1）及C-O-C醚键特征峰，确认了共聚物的化学结构。

**Confirmation of HSP entrapment by FT-IR**：HSP-PEGylated PLGA NPs和HSP-PEGylated PLGA FA NPs的FT-IR谱图中，HSP的酚羟基峰（3502 cm^?1）发生位移并展宽，表明HSP与聚合物形成了氢键，成功封装于NPs内。

**Physicochemical characterization (Drug content and entrapment efficiency)**：HSP在PEGylated PLGA NPs中的包封效率约89.34%，药物含量约97.56%；在FA靶向NPs中略低（87.34%和96.45%），归因于FA的空间位阻。高包封效率有利于在靶组织提供足量药物。

**Physicochemical characterization (Particle size and zeta potential)**：HSP-PEGylated PLGA NPs粒径约188 nm（PDI 0.183），FA靶向NPs粒径约205 nm（PDI 0.253）。FA修饰导致粒径略增。zeta电位分别为?35 mV和?25 mV，表明NPs具有物理稳定性，可减少聚集。

**Solid-state characterization (DSC)**：DSC显示纯HSP在231.04°C有尖锐吸热峰（结晶态），而两种NPs中该峰消失，代之以宽峰（213.61°C和272.09°C），表明HSP由晶态转变为无定形态，有利于溶解性提升。

**Solid-state characterization (PXRD)**：PXRD图谱中纯HSP具有高强度衍射峰（26.14°），而两种NPs仅出现宽弥散峰，HSP特征峰消失，进一步证实HSP在NPs中变为无定形。

**Solid-state characterization (FE-SEM)**：FE-SEM显示两种NPs呈光滑表面、略椭圆形态，粒径100–200 nm。FA靶向NPs出现轻微聚集，归因于FA引发的氢键和范德华力。

**In vitro dissolution**：纯HSP在72 h内释放仅约23%（pH 5.5和7.4）。两种NPs在pH 5.5下释放更快（约97%和96%），在pH 7.4下释放较慢（约89%和86%），呈现pH响应性。释放机制符合Higuchi模型（PEGylated PLGA NPs）或Korsmeyer–Peppas模型（FA靶向NPs），均为Fickian扩散（n<0.5）。酸性条件下增强的释放有利于肿瘤酸性微环境中的靶向递送。

**Anti-oxidation assay**：DPPH自由基清除实验显示，纯HSP清除率约73.36%，HSP-PEGylated PLGA NPs为76.71%，HSP-PEGylated PLGA FA NPs最高达81.56%。FA修饰进一步提高了抗氧化活性，可减轻氧化应激。

**Cell line studies (Cytotoxicity)**：MTT实验表明，HSP-PEGylated PLGA FA NPs对SKOV3细胞的IC₅₀值最低（约29 μM/mL），显著低于纯HSP（36 μM/mL）和PEGylated PLGA NPs（38 μM/mL），体现了FA受体介导的主动靶向增强的细胞毒性。

**Cell line studies (Qualitative drug uptake)**：共聚焦显微镜显示，经FA靶向NPs处理的SKOV3细胞中DAPI（蓝色）和FITC（绿色）荧光强度更高，细胞核碎裂明显，表明HSP通过叶酸受体介导内吞进入细胞，并诱导凋亡。

**Cell line studies (Flow cytometric analysis of cell apoptosis)**：流式细胞术定量凋亡结果显示，HSP-PEGylated PLGA FA NPs诱导早期凋亡约44%、晚期凋亡约35%，显著高于PEGylated PLGA NPs（早期27%，晚期33%）和纯HSP（极低）。FSC/SSC散射信号增强进一步证实了凋亡细胞的发生。

讨论部分：研究人员指出，合成的HSP-PEGylated PLGA FA NPs具有合适的物理化学性质，可在酸性微环境中持续释放HSP，并提高抗氧化能力。体外细胞实验证实，FA功能化显著增强了NPs对SKOV3细胞的细胞毒性、摄取和凋亡诱导能力。尽管如此，研究仍面临稳定性、靶向效率、安全性和监管审批等方面的挑战。未来需优化配体密度、引入稳定性增强剂、开展体内验证及安全性评估。

结论部分翻译：本研究成功开发并表征了HSP-PEGylated PLGA NPs和HSP-PEGylated PLGA FA NPs，用于上皮性卵巢癌（EOC）的治疗。所制备的NPs具有合适的物理化学性质，证实了HSP的成功封装并提高了其溶出度。两种NPs在酸性pH 5.5下72小时内的药物释放行为支持了HSP在肿瘤微环境中的持续和靶向释放。此外，抗氧化实验结果表明，合成的NPs因HSP抗氧化潜力增强而提高了自由基清除效率。对叶酸受体过表达的SKOV3细胞的体外研究表明，与HSP-PEGylated PLGA NPs相比，HSP-PEGylated PLGA FA NPs表现出增强的细胞毒性、细胞摄取和细胞凋亡诱导率。结果表明，合成的FA功能化NPs可作为有前景的靶向纳米载体，用于卵巢癌的有效治疗。尽管有这些优势，所合成的NPs仍面临稳定性研究、对过表达受体的靶向性、安全性和监管批准等挑战。因此，未来的研究应着重于靶向配体密度的选择和定量表征、稳定性增强剂的使用、合成和封装方法的优化、全面的体内验证研究、溶血试验以及使用正常细胞系的细胞相容性评估，以建立所合成的NPs的安全性档案，从而将实验室工作转化为临床研究。结果表明，HSP-PEGylated PLGA FA NPs有望作为有效的靶向纳米载体用于卵巢癌的治疗。