肿瘤性CD3+B细胞通过单细胞(scRNA-seq)及空间转录组(Stereo-seq)重塑弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)肿瘤微环境

《Cancer Biology & Therapy》：Neoplastic CD3? B cells remodel the DLBCL tumor microenvironment via single-cell and spatial transcriptomics

　　

摘要：本研究通过整合单细胞(single-cell)、单细胞核(single-nucleus)及空间转录组(spatial transcriptomics)技术，构建了弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B-Cell Lymphoma, DLBCL)的高分辨率多组学图谱。研究人员鉴定出一个既往未被识别、反复出现的恶性B细胞亚群——异常表达通常仅见于T细胞的CD3复合物的CD3+B细胞，该表型由涉及BCLAF1、CHURC1、FLI1、NFATC2和ELF2五个关键调控基因特定遗传回路驱动。空间及功能分析显示，此类细胞与巨噬细胞(macrophage)富集及M2型极化相关，可能通过转化生长因子-β(TGF-β)信号通路参与构建免疫抑制性肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)。临床分析中CD3+B细胞丰度与疾病晚期分期、治疗反应差及总生存期缩短相关。研究表明，具有T细胞样特征的CD3+B细胞亚群参与TME重塑并与不良临床结局相关，FLI1及TGF-β轴可作为潜在治疗靶点。

论文解读：肿瘤性CD3⁺B细胞通过单细胞及空间转录组重塑DLBCL肿瘤微环境

该研究发表于《Cancer Biology》。弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B-Cell Lymphoma, DLBCL)是最常见且具高度异质性的非霍奇金淋巴瘤，约40%患者经R-CHOP方案治疗后仍复发死亡，机制未明。传统研究认为DLBCL异质性源于肿瘤细胞起源亚型（GCB/ABC）及肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)组成，但批量测序或单一标志物定量难以捕捉罕见却具功能活性的细胞亚群及其空间互作关系，特定肿瘤细胞状态如何主动塑造免疫抑制微环境仍不清楚。为此，研究人员整合单细胞核RNA测序(snRNA-seq)、公共单细胞RNA测序(scRNA-seq, GSE182434)及纳米级空间转录组(Stereo-seq, 即Spational Enhanced REsolution Omics-sequencing)，结合132例福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, FFPE)组织免疫荧光(Immunofluorescence, IF)/免疫组化(Immunohistochemistry, IHC)临床验证及体外功能实验，旨在解析DLBCL细胞架构并探究肿瘤细胞内在状态对TME的重编程作用。研究发现DLBCL中存在罕见的CD3⁺B细胞恶性亚群，其受特定转录因子网络驱动，在空间上募集并极化M2样肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-Associated Macrophages, TAMs)，形成免疫抑制微环境，且细胞数量是DLBCL独立的不良预后因子。该发现拓展了对DLBCL瘤内异质性的认识，为预后评估和新靶点开发提供了依据。

主要关键技术方法

研究人员收集12例新鲜DLBCL肿瘤组织进行snRNA-seq，2例同期行Stereo-seq空间转录组检测；整合公共GSE182434数据集（4例scRNA-seq）进行交叉验证；132例独立FFPE组织用于多重IF/IHC定量CD3⁺B细胞及CD163⁺巨噬细胞并关联临床随访；另取6例新鲜组织分离淋巴细胞行流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)鉴定表型、Transwell迁移及条件培养基极化实验验证TAM互作；ELIZA检测上清细胞因子；生物信息学采用非负矩阵分解(Non-negative Matrix Factorization, NMF)解析恶性B细胞基因模块，pySCENIC推断转录调控网络(Regulon)，CellphoneDB预测细胞间配体-受体互作，inferCNV推断拷贝数变异(Copy Number Variation, CNV)，多元Cox回归评估独立预后价值。

研究结果

Identification and validation of CD3⁺B cells in DLBCL（DLBCL中CD3⁺B细胞的鉴定与验证）

研究人员对整合后的137,292个细胞进行无监督聚类注释，对64,113个恶性B细胞做NMF分解得到4个基因模块，其中Module 4高表达CD3D、CD3E、CD3G等T细胞特征基因，据此定义共表达B细胞标志(CD19、MS4A1/CD20)与CD3复合物的CD3⁺B细胞亚群（占恶性B细胞约2.14%）。排除DoubletFinder判定的双细胞假象后，在外部scRNA-seq队列及Stereo-seq中复现该群体；其CNV模式符合恶性B细胞特征；IF及FCM证实肿瘤组织中CD3与CD20共定位且外周血未见，确认其为真实存在的恶性B细胞亚群而非技术假象。

CD3⁺B cells display T cell-like transcriptomic signatures and secrete immunosuppressive TGF-^βfamily cytokines（CD3⁺B细胞呈现T细胞样转录组特征并分泌免疫抑制性TGF-^β家族细胞因子）

差异表达及基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)显示CD3⁺B细胞上调T细胞信号、T细胞耗竭/exhaustion及调节性T细胞(Treg)相关签名，高表达TGF-^β超家族成员GDF11、BMP6。ELIZA证实高比例CD3⁺B细胞的肿瘤淋巴细胞上清BMP-6和GDF-11升高、TNF-α降低，表明该亚群具T细胞样程序并分泌免疫抑制因子。

High CD3⁺B cell infiltration predicts poor survival in DLBCL（高CD3⁺B细胞浸润预示DLBCL不良生存）

132例FFPE组织IF定量显示，以中位数或每高倍视野＞10个为界，CD3⁺B细胞高密度/高数量组总生存期(Overall Survival, OS)与无进展生存期(Progression-Free Survival, PFS)均显著缩短（PFS: HR=2.513, p=0.0003）；与晚期临床分期(p_trend=0.0379)及疗效差(完全缓解CR少、进展性疾病PD多, p_trend=0.0205)相关。多因素Cox回归证实CD3⁺B细胞数量（非密度）是PFS(HR=2.918, p=0.002)和OS(HR=2.280, p=0.020)的独立不良预后因素。

CD3⁺B cells are spatially associated with an M2-like myeloid niche（CD3⁺B细胞在空间上与M2样髓系微环境相关联）

Stereo-seq显示距CD3⁺B细胞＜40 μm范围内髓系细胞（尤其巨噬细胞）显著富集，CD163⁺巨噬细胞呈空间偏好性聚集。CellphoneDB预测CD3⁺B细胞通过BMP6/GDF11-TGFBR等配体-受体对与髓系细胞强互作。邻近CD3⁺B细胞的髓系细胞上调血管生成、趋化及TGF-^β信号通路基因集，符合M2样极化特征。体外肿瘤上清极化实验证实高CD3⁺B细胞组来源上清可增加CD163⁺巨噬细胞比例(p=0.0494)。

A core transcriptional network mediates CD3⁺B-cell reprogramming（核心转录网络介导CD3⁺B细胞重编程）

伪时间(Pseudotime)轨迹示恶性B细胞从CD3^-经过渡态向CD3⁺B细胞分化，BCL11B、RUNX2、RUNX3沿轨迹渐升。整合Regulon特异性评分(Regulon Specificity Score, RSS)与Master Regulator分析锁定五个核心转录因子——BCLAF1、CHURC1、FLI1、NFATC2、ELF2，其活性与细胞黏附、免疫调节及TGF-^β信号正相关，并形成正反馈回路调控CD3D等下游靶基因。

Validation and specificity of the CD3⁺B-cell transcriptional network（CD3⁺B细胞转录网络的验证与特异性）

IF证实瘤内CD3⁺B细胞中BCLAF1与FLI1蛋白共表达；与公共ChIP-seq重叠分析显示pySCENIC预测靶基因显著富集于BCLAF1(15.9%)和FLI1(8.3%)启动子结合区(p<0.05)；五核心TF的Regulon活性在CD3⁺B细胞显著高于普通恶性及正常B细胞(p<0.0001)；CD3⁺B细胞同时富集增殖及癌干细胞基因签名。

讨论与结论

讨论指出既往文献多为散在CD3⁺DLBCL个案报道（常伴EBV/HIV免疫低下且弥漫强染），本研究首次以高分辨率多组学证实多数DLBCL中存在低频但重现性的CD3⁺B细胞亚群（中位~2%），区别于广泛CD3阳性病例（如本研外部队列中一例86.99%阳性考虑特殊病因）。该亚群由FLI1等核心TF回路内在驱动或由EBV/免疫缺陷等外在因素致广泛表达。CD3⁺B细胞数量（而非密度）为独立预后因子，可能反映全身免疫抑制负荷。其通过分泌BMP6/GDF11激活TGF-^β轴招募并极化M2样TAMs，塑造局部免疫抑制生态位，与不良转归相联。FLI1抑制剂（如TK-216）及TGF-^β通路抑制剂联合或为潜在干预方向。局限性含体外及空间样本量有限、TF网络上游触发机制未明、缺体内模型验证。

结论翻译

本研究在DLBCL中鉴定出一个独特的CD3⁺B细胞恶性亚群，阐明其受BCLAF1/CHURC1/FLI1/NFATC2/ELF2转录回路驱动、与M2巨噬细胞富集的免疫抑制微环境空间关联，且高丰度独立预示不良临床结局。上述发现深化了对DLBCL异质性的理解，确立该亚群为潜在预后生物标志物，FLI1及TGF-^β轴是关键候选治疗靶点。