《Cancer Biology & Therapy》：Leveraging the bacteria for enhanced cancer immunotherapy: from a perspective of synthetic biology
近年来，合成生物学（synthetic biology）已被广泛应用于工程和编程细胞行为。利用这一方法，细菌可被设计用于表达免疫治疗制剂、改善肿瘤靶向性，并将治疗性载荷直接递送至肿瘤部位。为进一步提高疗效，研究人员已探究了低氧响应启动子（hypoxia-responsive promoters）、细菌群集运动（bacterial swarming）及细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）等策略，以及细菌治疗与其他治疗方式（如光动力治疗、化疗、免疫检查点抑制剂）的协同效应。本综述总结了合成生物学在基于细菌的肿瘤免疫治疗中的最新进展，重点阐述细菌制剂如何激活免疫系统以及实现肿瘤靶向的工程策略。
2. 细菌治疗制剂对免疫系统的影响
本章节聚焦细菌制剂激活宿主抗肿瘤免疫的基本免疫学机制，为第4章所述治疗策略的转化应用提供机制基础。研究人员首先剖析由细菌病原体相关分子模式（PAMPs）触发的先天免疫通路，继而分析适应性免疫的后续参与机制。
2.1. 细菌PAMPs作为抗肿瘤先天免疫的激活剂
细菌免疫治疗主要通过病原体相关分子模式（PAMPs）激活先天免疫系统而发挥抗肿瘤效应。这些被称为PAMPs的微生物结构由免疫细胞表面或内部的模式识别受体（PRRs）识别。该识别启动下游信号通路，触发先天免疫激活并塑造适应性免疫。关键细菌PAMPs及其受体包括：可被Toll样受体4（TLR4）识别的脂多糖（LPS）；可被TLR5检测的鞭毛蛋白（flagellin）；可作为TLR9配体的非甲基化CpG富集细菌DNA；以及可激活细胞内核苷酸结合寡聚化结构域蛋白1和2（NOD1/2）受体的肽聚糖片段。PRRs（包括TLRs）对PAMPs的初始识别触发免疫刺激性级联反应，激活免疫细胞并诱导炎症介质产生。后续研究表明，PRR engagement通过TIR结构域相互作用招募髓样分化初级反应蛋白88（MyD88）或含TIR结构域的干扰素β诱导接头蛋白（TRIF）等接头蛋白，形成启动下游通路的信号复合物。MyD88依赖性信号激活核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联，驱动促炎细胞因子（包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和IL-12）的表达。这些细胞因子激活自然杀伤（NK）细胞和巨噬细胞等先天效应细胞，调节免疫细胞募集并放大炎症反应。相反，TRIF依赖性信号诱导I型干扰素（IFN）产生，通过增强NK细胞细胞毒性和促进树突状细胞（DCs）成熟直接增强先天抗肿瘤免疫。细菌免疫治疗制剂作为强效的PAMP递送系统；一个显著例子是卡介苗（Mycobacterium bovis BCG），其为强效的TLR2/4/9激动剂，广泛应用于膀胱癌治疗。PRR激活的关键结果之一是DCs的成熟与迁移，这显著提高了其分泌免疫刺激性细胞因子和激活NK细胞等先天淋巴细胞的能力，从而增强早期先天抗肿瘤反应。这些机制不仅放大了先天免疫应答，还为启动适应性免疫提供了必需信号。
2.2. 利用适应性免疫实现抗肿瘤反应
本章节旨在阐述细菌免疫治疗调动适应性免疫系统以实现靶向且持久抗癌效应的机制。讨论围绕三个关键过程展开：抗原特异性T细胞激活、免疫记忆形成，以及放大这些效应的联合治疗策略的 strategical 应用。这些机制原理随后体现于具体治疗设计中，如工程化细菌递送肿瘤相关抗原或免疫调节融合蛋白，将在第4章探讨。
除激活先天免疫外，细菌免疫治疗制剂还参与适应性反应以实现肿瘤特异性效应。该过程中的关键事件是DCs的激活，其桥接先天与适应性免疫。细菌 encounter 后，DCs将抗原呈递于主要组织相容性复合体（MHC）分子上供T细胞识别。这些抗原包括恶性细胞表达的肿瘤相关或肿瘤特异性抗原，以及细菌抗原。强效细菌PAMPs如鞭毛蛋白（FlaB）可作为强效免疫刺激剂。例如，通过TLR5进行的鞭毛蛋白信号促进树突状细胞成熟并塑造适应性免疫反应，Th极化方向具有环境依赖性，受局部细胞因子微环境影响。这种抗原呈递细胞（APCs）的激活导致共刺激分子上调和抗原呈递增强。 consequently，这引发针对细菌载体的 robust T细胞反应。通过表位扩散或旁观者效应等机制，这种激活的免疫状态可被重新定向对抗肿瘤，将细菌免疫刺激与抗肿瘤免疫联系起来。为利用这一点，工程化细菌常被设计用于递送确定的肿瘤抗原。一个显著例子是表达人乳头瘤病毒（HPV）E7蛋白的减毒李斯特菌（Listeria monocytogenes）用于宫颈癌治疗。该策略激活细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），实现肿瘤细胞的识别与清除。因此，肿瘤内CTL浸润程度被认为是强有力的预后指标。
细菌制剂还调节辅助性T细胞亚群，特别是Th1和T辅助17（Th17）细胞，诱导IFN-γ和IL-17等细胞因子的分泌，从而增强炎症反应和免疫监视。其中，IFN-γ通过促进的前提是促进抗原呈递并上调肿瘤细胞MHC表达，从而暴露更多肿瘤相关抗原（TAAs）和肿瘤特异性抗原（TSAs）供CTL识别。此外，细菌免疫治疗驱动免疫记忆的形成，为肿瘤复发提供快速而持久的保护。为放大这些适应性免疫反应，联合策略正被积极探究。这些策略包括合成TLR激动剂（如单磷酸脂质A [TLR4]、CpG寡脱氧核苷酸 [TLR9]）和干扰素基因刺激因子（STING）激动剂（如cGAMP衍生物、DMXAA类似物），它们与细菌PAMPs协同作用，放大DC激活、细胞因子产生和T细胞 priming。例如，某些胞内细菌如李斯特菌天然产生环二腺苷酸（c-di-AMP），这是一种强效STING激动剂，与细菌PAMPs协作增强I型干扰素产生和抗肿瘤T细胞反应。
除这些直接PAMP-受体相互作用外，细菌成分还可重塑肿瘤微环境（TME）的免疫设定点以增强适应性免疫。例如，肠道来源的LPS通过TLR4/MyD88/AKT/NF-κB信号级联刺激T细胞浸润，重塑胰腺肿瘤微环境。这种LPS驱动的通路转录上调肿瘤细胞PD-L1表达，从而创造PD-L1检查点阻断与重塑的免疫环境协同抑制肿瘤生长的条件。
3. 细菌治疗制剂的生产
当代细菌免疫治疗制剂从发现到临床应用遵循明确的转化流程。这一多阶段工作流涵盖安全、肿瘤靶向细菌底盘的理性选择与工程化，严格的临床前和临床验证，以及最终可规模的现行药品生产质量管理规范（cGMP）生产。
理想的细菌底盘必须具有低致病性、良好的安全性和固有的肿瘤趋向性。常见候选菌株包括减毒沙门氏菌（Salmonella spp.）、大肠杆菌（Escherichia coli）和李斯特菌（Listeria monocytogenes）的减毒株。其遗传工程依赖于多功能载体系统。除合成质粒外，细菌天然（隐蔽）质粒的策略性工程化在宿主兼容性和稳定、无抗生素维持方面具有优势。对于稳定的基因组整合，基于质粒的同源重组仍然是基本策略。
精确的基因修饰采用传统和先进的基因组编辑技术。虽然成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9广泛用于靶向基因敲除，CRISPR/Cas12a平台已作为多重编辑的有力替代方案出现。Cas12a处理自身向导RNA阵列的能力促进多个靶点的同时调控。例如，基于dCas12a的"MultiduBE"系统实现多重碱基编辑以驱动细菌中复杂的代谢重编程。同时，优化转基因表达至关重要。密码子优化已进化为平衡密码子偏好与翻译动力学和蛋白质折叠的复杂策略。先进的深度学习模型现在智能设计编码序列以最大化细菌底盘（如大肠杆菌）中的异源蛋白表达，显著提高治疗蛋白产量。
工程化菌株经纯化以确认基因型稳定性和表型一致性。基因型验证采用PCR或Sanger测序。表型特征（包括抗生素敏感性、生长动力学和治疗蛋白表达）通过纸片扩散试验、ELISA或免疫印迹进行表征。为改善细菌稳定性和功能性，研究人员探索了纳米颗粒封装策略。例如，脂质体涂层增强对胃酸的抵抗力，而金纳米颗粒偶联改善光声成像和杀菌特性。
经成功临床前验证后，治疗批次按临床需求生产。该生物加工流程包括生物反应器培养、生物质收获、纯化和最终制剂。中空纤维生物反应器（HFBs）、连续离心、切向流过滤和亲和层析等技术在药品生产质量管理规范（GMP）标准下实施。随后，进行分阶段临床试验——从临床前研究到III期——以评估药代动力学、安全性和有效性，这是向临床转化迈出的关键一步。监管批准后，制造工艺经迭代优化以提高产量、降低生产成本、增强产品质量，并探索新的治疗应用。
合成生物学和纳米技术的进步改变了规模化细菌生产的格局，为下一代免疫治疗提供了创新策略。
4. 基于细菌的肿瘤免疫治疗策略
基于第2章所述基本免疫学机制，本章探讨其转化应用。研究人员将多样的基于细菌的抗癌策略分类为不同的治疗范式，并详述其设计、递送和临床潜力。
基于细菌的抗癌策略可根据应用模式 broadly 分为两个不同范式：直接和间接应用。直接策略采用活细菌——野生型（WT）或工程化——作为瘤内制剂，局部递送治疗药物、诱导溶瘤或调节TME。间接策略利用细菌成分（如外膜囊泡、减毒株）或生物工程化细菌作为体外生产平台，生产疫苗、病毒载体或免疫刺激性分子，然后单独给药。
4.1. 通过合成生物学工程化肿瘤趋向性
作为直接应用策略，细菌肿瘤趋向性可分为两类：非工程化（天然）趋向性和工程化趋向性。非工程化趋向性依赖于某些细菌物种的固有几何特性——如大肠杆菌和沙门氏菌的兼性厌氧代谢驱动其定植于缺氧的肿瘤核心，或对肿瘤衍生代谢物的天然趋化性。相比之下，合成工程化细菌表现出增强的或全新的肿瘤趋向性，通过基因修饰实现，使其能够对TME中的程序性趋化线索作出反应，从而实现免疫治疗制剂的靶向递送。这种选择性靶向减少脱靶细胞毒性。
细菌在肿瘤中的积累通过被动和主动机制发生。被动靶向由渗漏肿瘤血管中的增强渗透和滞留（EPR）效应介导，而主动趋向性由对缺氧、坏死和代谢梯度的工程化或天然响应以及工程化传感电路驱动。重要的是，肿瘤内天然肿瘤相关细菌（TAB）的作用复杂且情境依赖。某些物种，如结直肠癌中的具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）和肺癌 fps 中的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），已被证明主动促进肿瘤进展。它们通过形成保护性生物膜、分泌保护肿瘤细胞免于铁死亡的代谢物（如铁载体绿脓菌素）以及诱导上皮-间质转化等机制实现。这种双重性质——既是TME的组成部分又是潜在的恶性驱动因素——凸显了理解天然细菌趋向性的意义。
虽然上述机制代表固有细菌特性，合成生物学能够实现肿瘤趋向性的理性设计和增强。合成生物学使细菌能够响应TME特异性信号，包括酸性pH和肿瘤衍生代谢物。缺氧作为TME的标志，驱动代谢重编程、侵袭、转移、放射抵抗和免疫逃逸。虽然大肠杆菌Nissle 1917（EcN）和沙门氏菌等兼性厌氧菌通过其固有代谢多功能性自然定植于缺氧肿瘤区域，合成工程化努力主要集中于 rewiring 细菌以 sensing 和响应其他未被自然利用的TME线索。此外，工程化常 co-opts 天然TAB策略。例如，细菌可被设计为感应和响应酸性、富含乳酸盐的TME，将治疗基因表达限制于肿瘤以增强特异性。
遗传工程还可通过赋予细菌合成黏附特性来增强肿瘤趋向性。Pi?ero-Lambea等开发了模块化合成黏附素（SA）平台，将肠致病性大肠杆菌天然Intimin黏附素的免疫球蛋白样结构域替换为单域纳米抗体（VHHs）。通过选择识别肿瘤相关抗原（如HER2）的纳米抗体，工程化细菌获得了从头肿瘤特异性黏附，并以显著高于非黏附对照的效率定植于表达相应抗原的实体瘤。与基于黏附的靶向互补，细菌还可配备工程化传感系统以检测实体瘤内的代谢梯度。Panteli和Forbes证明，工程化表达葡萄糖传感趋化受体（Trz1）的大肠杆菌可检测实体肿瘤细胞团内的葡萄糖浓度空间分布，使细菌能够主动追踪代谢异质性肿瘤区域产生的糖梯度——这是被动扩散 alone 无法达到的能力。此外，肿瘤细胞进行有氧糖酵解，产生乳酸并酸化TME。这种由组蛋白赖氨酸乳酸化（Kla）增强的酸性环境促进肿瘤进展。因此，工程化酸响应细菌系统以分泌酶抑制剂或溶菌素，调节TME生物化学并损害肿瘤活力。
除环境响应性外，细菌群集行为（BSB）以铜绿假单胞菌为例，提供了深层肿瘤穿透的运动机制。群集期间，铜绿假单胞菌形成多细胞筏，通过鞭毛推进在表面快速迁移，产生复杂的涡旋模式。在癌症应用中，这一天然群集能力被工程化沙门氏菌鞭毛系统所利用，以增强瘤内浸润和复制，创造新的治疗机会。临床转化需要详细理解群集动力学，包括集体迁移期间的裂变-融合动力学。为此，趋化行为正在被 reprogrammed 以优化肿瘤定向迁移，而鞭毛蛋白生物合成或c-di-GMP信号的小分子抑制剂被用于空间约束细菌扩散。
总体而言，天然细菌趋向性与合成再工程之间的相互作用——从利用固有厌氧代谢到编程新的传感电路和群集机制——实现了精确治疗递送同时最小化 collateral 组织损伤。
4.2. 靶向癌症治疗：细菌偶联物和细胞外囊泡
肿瘤特异性递送的替代策略采用细菌-纳米颗粒偶联物和细菌细胞外囊泡（BEVs）作为工程化平台。这些系统与趋向性细菌协同作用以增强靶向精度，主要代表间接应用范式，其中细菌成分或工程化载体在体外生产并给药，而非依赖于瘤内细菌定植。
细菌-纳米颗粒偶联物整合合成生物学和纳米医学原理，利用细菌趋向性实现位点特异性纳米载体沉积。纳米颗粒（NP）特性——包括尺寸、形态、表面电荷和材料组成——可被调节以优化药物装载、释放动力学和生物相容性。例如，结直肠癌膜包覆的介孔二氧化硅NPs（Mel-SiO?@CCM）利用同型黏附进行肿瘤靶向，并通过Gal-GalNAc-Fap2相互作用选择性消除具核梭杆菌，通过双重溶菌和免疫调节效应实现91%的肿瘤抑制。功能化NPs实现多样化载荷的时空递送，包括化疗药物和siRNAs。例如，鞭毛-药物纳米偶联物（FDNCs）利用鞭毛免疫原性增强细胞摄取，并通过酸不稳定连接子实现触发释放。NP选择取决于治疗目标：磁性NPs促进磁热疗，金NPs通过高效光转化实现光热治疗，二氧化硅NPs作为稳健的递送载体。机制上，这些偶联物介导直接杀肿瘤效应、免疫激活、血管生成抑制和增强的瘤内药物积累。尽管有这些优势，转化挑战仍然存在。关键障碍包括生物安全性顾虑、免疫清除、NP药代动力学优化和可规模化生产。
同时，细菌细胞外囊泡（BEVs）因其固有生物相容性、稳定性和肿瘤归巢能力而作为有前景的纳米载体出现。这些脂质双层囊泡通过运输蛋白、核酸和代谢物介导细胞间通讯。BEVs可通过内吞或膜融合被肿瘤细胞内化，实现高效的载荷递送。例如，双歧杆菌BEVs在递送治疗制剂的同时固有抑制三阴性乳腺癌生长。类似地，乳酸菌来源的BEVs通过运输免疫刺激剂和将巨噬细胞重极化为抗肿瘤表型而充当免疫治疗载体。为进一步增强偶联物和BEVs的性能，表面功能化策略——包括共价偶联或物理吸附——将肽或抗体等靶向配体附着于纳米颗粒或BEV膜，从而改善肿瘤特异性和治疗载荷递送。
4.3. 合成生物学的具体应用：从基因编辑到免疫调节
该直接应用策略采用能够定植肿瘤并在TME内执行局部基因组编辑或免疫调节的活工程化细菌载体。细菌基因组编辑是编程细菌以递送肿瘤特异性抗原或免疫调节剂的关键工具。在可用技术中，CRISPR-Cas系统以其高效率和多重靶向脱颖而出；然而，其应用受限于原间隔区邻近基序（PAMs）的需求和持续的脱靶效应风险。为提高CRISPR-Cas9特异性，研究人员积极追求向导RNA（gRNA）设计优化、Cas9蛋白工程和递送系统创新等策略。
与这些基因组修饰互补，合成生物学电路 increasingly 纳入可调基因表达模块。基因沉默工具——如CRISPR干扰（CRISPRi）、转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）和RNA干扰（RNAi）——允许精确敲低靶基因，尽管可能产生 transient 效应和脱靶转录本降解。相反，基因过表达系统增强免疫刺激性细胞因子的产生，但面临在TME内实现精确时序控制的挑战。例如，Mansurov等证明工程化细菌可被编程以局部过表达白细胞介素-12（IL-12）等细胞因子，最大化抗肿瘤效应同时最小化全身毒性。
除基因组操作外，活细菌载体可在TME内以情境依赖方式调节免疫反应。这些构建体诱导细胞因子分泌，包括IL-2、TNF-α和IFN-γ，激活免疫效应子并增强肿瘤清除。例如，表达IL-12的鼠伤寒沙门氏菌刺激Th1极化免疫并增强CTL活性。类似地，减毒沙门氏菌通过AKT/mTOR信号下调上皮细胞黏附分子（EpCAM）以抑制转移，而多精氨酸包被的抗原递送建立抗原特异性CD8? T细胞免疫，可与I型干扰素佐剂协同增强。工程化大肠杆菌Nissle 1917同样定植肿瘤，将氨转化为L-精氨酸，递送PD-L1阻断抗体，并增强免疫介导的清除。
关键的是，合成基因电路实现细菌活力和治疗产出的时空控制，确保局部细胞因子产生和随后的清除。这些反馈调节系统响应多种TME线索。尽管有这些进展，次优的抗原呈递效率仍然是挑战，激励开发动态调节电路以增强CD4?/CD8? T细胞在肿瘤清除中的协作。值得注意的是，唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素G（Siglec-G）调节树突状细胞介导的CD8? T细胞 priming，strategic 操纵该通路可放大抗原呈递并改善疫苗效力。
同时，细菌递送的免疫检查点抑制剂（ICIs）靶向程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）、PD-L1和CTLA-4已显示出治疗潜力。为降低与全身性单克隆抗体相关的免疫相关不良事件（irAEs），工程化细菌可作为局部ICI递送平台。例如，Shapiro等开发了在肿瘤内 exclusively 产生抗PD-L1和抗CTLA-4抗体的热响应性细菌菌株。
超越局部递送，工程化细菌已被开发为全身性抗癌疫苗。通过利用其固有PAMPs作为内建佐剂，细菌载体向APCs递送肿瘤抗原并引发持久的T细胞免疫——解决了常规肽疫苗常缺乏足够免疫原性的关键局限。临床上，最先进的例子是ADXS11-001，一种分泌HPV E7-LLO融合蛋白的减毒活李斯特菌，在随机II期宫颈癌试验中实现了客观肿瘤反应。更近地，Redenti等工程化益生菌大肠杆菌Nissle 1917以递送患者特异性新抗原阵列，在 preclinical 模型中引发强效的CD4?和CD8? T细胞反应，控制已建立的原发性和转移性肿瘤，并与抗PD-L1阻断协同作用。
4.4. 细菌溶瘤和病毒治疗
肿瘤选择性溶瘤细菌和病毒代表了利用病原体趋向性选择性破坏恶性细胞的新兴治疗方式。本章节分为两个互补策略：直接细菌溶瘤，以及细菌与溶瘤病毒治疗的整合，包括细菌介导的病毒递送和直接病毒溶瘤。
4.4.1. 直接细菌溶瘤
溶瘤细菌采用多种机制实现肿瘤特异性易位，包括血管外渗、间质迁移和直接细胞侵袭。合成工程化的Salmonella YB1是一种氧敏感减毒株，通过IFN-γ和NK细胞依赖性免疫机制抑制转移，其中NK细胞来源的IFN-γ促进NK细胞对转移癌细胞的积累、激活和细胞毒性；而梭菌属（Clostridium spp.）通过外毒素释放裂解肿瘤细胞，募集免疫效应子并增强抗肿瘤免疫。机制上，艰难梭菌外毒素A和B介导不同效应：毒素A增加血管通透性以促进免疫细胞浸润，而毒素B结合细胞表面受体诱导凋亡。此外，工程化合成和局部释放细胞毒性载荷（如小分子、免疫毒素）的沙门氏菌和大肠杆菌深刻重塑TME。
4.4.2. 细菌介导的病毒递送和直接病毒治疗
超越直接细菌溶瘤，快速发展的策略利用细菌肿瘤趋向性克服传统病毒治疗的药代动力学限制，如快速的全身清除和差的肿瘤穿透。通过作为溶瘤病毒或其遗传物质的递送载体，细菌将其固有的肿瘤靶向能力与病毒的强效溶瘤和免疫刺激特性相结合。
共价连接的可编程多糖封装沙门氏菌用于细胞内递送（CAPPSID）平台 exemplifies 创新递送策略，使用工程化鼠伤寒沙门氏菌将溶瘤塞内卡病毒A RNA直接运输至肿瘤细胞，其中细菌裂解释放病毒基因组，启动可绕过循环抗病毒抗体的强效溶瘤病毒感染。类似地，近期进展包括设计用于保护和递送溶瘤病毒（如小鼠微小病毒MVMp）基因组进入癌细胞的"病毒递送沙门氏菌"（VDS）菌株，导致成功的瘤内病毒传播和强效的旁观者效应。
此外，溶瘤病毒治疗利用病毒趋向性选择性感染和裂解恶性细胞。当代研究表明溶瘤病毒不仅诱导直接溶瘤，还 elicit 全身性抗肿瘤免疫——当与免疫检查点抑制剂或肿瘤抗原疫苗联合使用时，这种免疫刺激效应进一步 potentiated。基于这些固有特性，溶瘤病毒可直接应用或经基因工程化实现肿瘤选择性破坏，代表病毒治疗范式内的互补策略。病毒治疗主要利用病毒的自然特性或基因工程进行靶向感染和裂解肿瘤细胞。经修饰的腺病毒和单纯疱疹病毒（HSV）株通过在肿瘤细胞内复制、诱导细胞裂解和刺激机体免疫记忆，在肿瘤治疗中显示出显著疗效。此外，合成生物学工具已被用于设计能够感知和响应TME的基因电路。这种能力实现了病毒活性的按需控制和自主载荷释放。病毒治疗还通过递送治疗基因或免疫刺激分子来激活或增强宿主免疫系统并加强对肿瘤的免疫反应，从而增强肿瘤杀伤。
4.5. 细菌治疗中的模块化和限制系统
模块化设计和生物限制系统的实施对于开发安全有效的细菌免疫治疗至关重要。这些基础技术为直接和间接治疗策略提供必要的安全和控制机制，确保无论递送模式如何，都能对治疗活动进行精确的空间和时间调控。生物限制限制细菌增殖和扩散以防止脱靶毒性。例如，亮氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌A1-R需要外源性亮氨酸才能存活，限制其在体内的扩增。自杀基因系统提供密度依赖性控制，在阈值群体触发自溶以维持生态平衡。Din等的同步裂解电路（SLC）exemplifies 这一方法：细菌群体感应诱导裂解因子产生，释放治疗制剂同时调节群体动力学。
模块化设计策略通过整合各种功能模块（包括靶向、释放和安全模块）增强治疗剂的灵活性和可控性。该设计范式能够定制细菌行为以满足特定治疗需求，从而提高治疗策略的精度和安全性。靶向模块主要修饰细菌表面蛋白或配体以实现与肿瘤细胞的选择性结合。例如，Massa等通过将抗CD20抗体偶联至沙门氏菌表面，增强细菌在肿瘤部位的聚集并提高对CD20?淋巴瘤的侵袭性。类似地，Park等通过将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽 incorporate 细菌外膜蛋白A，赋予细菌特异性结合过表达αvβ3整合素的能力，在黑色素瘤和乳腺癌异种移植模型中产生显著靶向抗肿瘤效应。
释放模块控制细菌递送治疗制剂的时机和剂量，利用细菌的天然分泌途径，如III型分泌系统（T3SS），有效靶向宿主细胞膜或细胞质并激活特定免疫反应。安全模块则包括自杀电路或外部控制的杀伤开关以确保治疗过程的安全。已识别出两类主要杀伤开关："dead man"杀伤开关和"密码子"杀伤开关。"Dead man"杀伤开关通过与特定输入信号结合的不平衡转录阻遏维持细胞活力，而"密码子"杀伤开关采用两层转录结构，结合一组混合LacI-GalR转录因子通过三种不同信号调节细菌存活。这些模块的整合确保精确、受控的治疗作用。
4.6. 个性化和智能细菌治疗
微生物组信息的个性化疗法和环境响应性"智能"细菌代表了先进的转化范式。这些方法战略性地利用直接瘤内机制和间接全身效应以实现精准肿瘤学目标。
肿瘤-微生物组相互作用显著影响致癌作用、治疗反应和免疫治疗疗效。稀有共生菌株可作为新型生物治疗制剂，患者特异性微生物群分析可指导治疗细菌的选择。例如，经遗传修饰的肠道共生菌被工程化以在TME内释放抗癌制剂。Tanoue等证明明确的李斯特菌联合体增强宿主抵抗力并增强ICI疗效。瘤内微生物群也调节化疗抗性；例如，梭杆菌属赋予吉西他滨耐药性。目前，个性化疗法旨在通过利用患者微生物组改善对特定肿瘤的免疫反应，如使用工程化益生菌株递送抗肿瘤药物。
智能细菌治疗利用能够 sensing 特定TME信号的工程化细菌选择性释放治疗制剂——包括化疗药物、免疫刺激因子或溶源性病毒。这种按需释放最小化全身毒性并增强治疗疗效。当这些细菌与纳米载体结合时，治疗精度进一步提高，可在肿瘤部位实现更高的药物浓度。尽管临床上尚处于初期，这些策略为精准肿瘤学提供了变革性潜力。
5. 基于细菌的组合治疗的发展
多机制免疫治疗已成为肿瘤的 superior 策略。尽管常规治疗方式——包括化疗、放疗和免疫治疗——仍是治疗基石，临床证据证明了单药治疗的次优疗效。同样，独立的细菌免疫治疗很少实现完全肿瘤清除。因此，细菌介导的协同方案正被积极探究。
5.1. 与光动力治疗联合
光动力治疗（PDT）利用光敏剂在氧介导的光激活下产生活性氧（ROS）。尽管具有保留组织的优势，PDT疗效受限于 suboptimal 的光敏剂生物分布、有限的光穿透和肿瘤缺氧。细菌介导的递送系统精确克服这些局限。
5.2. 与光热治疗联合
光热治疗（PTT）通过光热剂（PTAs）将近红外（NIR）光转化为局部高温选择性消融肿瘤。虽然以非侵入性和精确性著称，PTT疗效因PTA积累不足、组织衰减和氧依赖性而受损。细菌来源的纳米平台提供了创新解决方案。
5.3. 与韶射治疗联合
放疗（RT）通过电离辐射诱导DNA损伤根除肿瘤。然而，脱靶暴露风险损伤邻近健康组织，引起急性/慢性毒性。此外，放疗诱导的TME改变——包括血管稀疏和缺氧—— Mobilize 放射抵抗，从而降低治疗疗效。因此，细菌增强的放疗代表规避这些局限的有前景策略。
5.4. 与化疗药物联合
尽管治疗进步，化疗仍是肿瘤学的基石，但面临剂量限制性毒性、肿瘤异质性和多药耐药。细菌介导的药物递送利用肿瘤趋向性和缺氧穿透增强精度和安全性。
5.5. 与免疫检查点抑制剂联合
人体肠道微生物群作为居住在胃肠道的复杂生态系统， increasingly 被认识为宿主免疫的关键调节因子和癌症治疗反应的决定因素。超越其局部效应，肠道微生物组 exert 全身性影响，塑造肿瘤免疫微环境从而影响抗癌治疗（特别是免疫检查点阻断ICB）的疗效。
5.6. 与溶瘤病毒治疗联合
如4.4节所述，溶瘤病毒选择性感染和裂解肿瘤细胞同时 elicit 全身性抗肿瘤免疫。本章节聚焦溶瘤病毒与肿瘤靶向细菌协同给药作为独特联合范式。
5.7. 与其他癌症治疗联合
细菌免疫治疗和铁死亡诱导的汇聚代表新兴抗癌范式。铁死亡——以铁依赖性磷脂过氧化为特征——通过损伤相关分子模式（DAMPs）释放激活树突状细胞来 potentiate 抗肿瘤免疫。
6. 基于细菌的肿瘤免疫治疗的临床试验
基于细菌的肿瘤免疫治疗正接受广泛临床评估，主要利用四种微生物载体（表2）。 notably，膀胱内卡介苗（Mycobacterium bovis BCG）仍是非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）的一线治疗，其 established 耐受性和安全性 profile 得到支持。其遗传减毒衍生物VPM1002BC在临床试验中显示出改善的治疗反应。
7. 基于细菌的肿瘤免疫治疗的转化挑战与机遇
过去十年合成生物学的突破改变了细菌肿瘤免疫治疗的格局，使工程化载体能够在TME内选择性增殖并抑制肿瘤生长。然而，这一 rapid 进展受制于转化障碍，包括固有细菌细胞毒性、制造复杂性和未解决的临床安全-疗效范式。
主要挑战在于细菌载体工程期间减轻固有致病性。减毒策略常采用CRISPR-Cas9介导的毒力决定因子灭活，如减毒李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌疫苗的开发中所 exemplified。这些方法降低致病潜力同时保留或增强抗肿瘤疗效。
制造可扩展性和质量保证仍是重要的转化挑战。为提高生产效率和产品质量，研究人员实施了先进的生物反应器技术、多步纯化流程和严格的质量控制措施，包括全面的安全性评估和分子动力学模拟。这些策略旨在确保整个制造 pipeline 的安全性和有效性。
8. 展望
合成生物学与细菌免疫治疗的汇聚代表了肿瘤学的范式转变，提供了 substantial 治疗前景。生物工程和纳米技术的进步推动了能够破坏代谢通路并 elicit robust 抗肿瘤免疫反应的肿瘤靶向工程细菌的发展。这一新兴领域引入了创新的转化策略，包括基于微生物群的干预、多模式联合治疗，以及利用细菌成分作为治疗制剂。
微生物组工程——由合成生物学赋能——实现微生物载体的精确基因修饰，将其转化为原位递送免疫治疗载荷（如纳米抗体、PAMPs、STING激动剂和细胞因子）的 localized 生物工厂。然而，STING激动剂的临床转化仍受限于代谢不稳定性和脱靶免疫激活。为应对这些挑战，已开发纳米激动剂制剂和工程化益生菌以增强靶向特异性并改善安全性，从而促进临床应用。尽管有令人鼓舞的临床前数据，成功的临床实施需要严格的安全性验证、TME内的疗效确认，以及建立符合GMP的大规模生产 pipeline。
重要的是，环境响应性细菌载体通过传感TME线索实现肿瘤选择性药物递送。将细菌免疫治疗与光热、光动力、放射或化学治疗佐剂整合的联合策略可克服抵抗机制并增强总体疗效。这些综合方法共同为肿瘤异质性和获得性抵抗的挑战提供了解决方案，推进下一代多模式肿瘤治疗范式。
最终，合成生物学驱动的创新为高度靶向、高效和个性化的肿瘤治疗铺平了道路。持续的跨学科合作对于克服转化障碍至关重要。随着持续创新和临床验证，细菌免疫治疗 poised 成为肿瘤学武器库中的基石，为癌症患者提供变革性治疗选择。
