《Drug and Chemical Toxicology》：Mechanistic insights into chlorpyrifos-induced nephrotoxicity revealed by network toxicology and molecular docking
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毒死蜱（chlorpyrifos，CPF）是一种广泛使用的有机磷农药，具有潜在的肾毒性风险，但其分子机制尚未完全阐明。本研究整合了网络毒理学、分子对接、分子动力学（MD）模拟和体外实验，系统地探索了CPF诱导的肾损伤机制。ADMET和毒性预测表明CPF具有潜在
毒死蜱（chlorpyrifos，CPF）是一种广泛使用的有机磷农药，具有潜在的肾毒性风险，但其分子机制尚未完全阐明。本研究整合了网络毒理学、分子对接、分子动力学（MD）模拟和体外实验，系统地探索了CPF诱导的肾损伤机制。ADMET和毒性预测表明CPF具有潜在的肾毒性风险。通过跨数据库筛选，识别出33个重叠靶点，并通过蛋白质-蛋白质相互作用网络分析进一步筛选出七个核心靶点：MPO、XDH、TLR4、NFE2L2、NOS2、NOS3和SOD2。富集分析显示，这些靶点显著参与氧化应激、炎症反应和HIF-1信号通路。分子对接和100纳秒（ns）的MD模拟显示，CPF及其代谢物与核心靶点稳定结合。使用HK-2细胞的体外实验证实，CPF上调了MPO表达，并诱导了氧化损伤和炎症反应，而MPO敲低可减轻这些效应。这种多层次策略揭示了CPF可能通过氧化应激和炎症激活触发肾毒性，为其毒理学机制提供了新的见解。
本研究发表于《Drug and Chemical Toxicology》，旨在系统揭示毒死蜱（chlorpyrifos，CPF）诱导肾毒性的分子机制。CPF是一种广泛应用的有机磷农药，虽然其急性神经毒性机制已知，但关于其肾毒性的分子机制研究仍不充分。现有研究多停留在表型层面，缺乏对关键靶点和通路的深入解析。为此，研究人员采用网络毒理学、分子对接、分子动力学（MD）模拟及体外实验相结合的多层次策略，从预测到验证全面探索CPF致肾损伤的机制。
研究人员首先利用ADMETlab 3.0和ProTox 3.0平台进行毒性预测，明确CPF的肾毒性风险及结构警报。基于CPF的SMILES结构，通过PharmMapper、Super-PRED、SwissTargetPrediction和TargetNet预测其潜在靶点，并与GeneCards和OMIM数据库中肾损伤相关靶点取交集，获得33个重叠靶点。通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，利用Cytoscape的多种算法筛选出7个核心靶点：MPO、XDH、TLR4、NFE2L2、NOS2、NOS3和SOD2。随后进行GO（基因本体）和KEGG（京都基因与基因组百科全书）富集分析，揭示这些靶点主要富集于氧化应激、炎症反应和HIF-1信号通路。分子对接和100 ns的MD模拟验证了CPF及其代谢物（CPF-oxon和TCP）与核心靶点的结合稳定性和亲和力。在体外实验中，以人肾近端肾小管上皮细胞（HK-2）为模型，通过CCK-8法检测细胞活力、RT-qPCR（实时荧光定量逆转录聚合酶链反应）和Western blot检测MPO表达，并使用siRNA敲低MPO，结合ELISA检测氧化应激指标（SOD活性、MDA含量）和炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）mRNA水平，以及Western blot检测PHD2/HIF-1α/VEGF通路蛋白表达。所有统计分析基于R或GraphPad Prism，使用t检验或单因素方差分析。
研究结果如下：
**3.1 CPF的结构警报、ADMET性质及肾毒性风险评估**
通过ADMETlab 3.0分析，CPF具有多种结构警报（如急性毒性、水生态毒性等），其高血浆蛋白结合率（99.446%）和低游离分数（0.321%）提示其倾向于在组织中蓄积；CPF被预测为P-糖蛋白（P-gp）抑制剂和OATP1B1/1B3抑制剂，可能影响肾脏药物转运；此外，CPF在药物诱导的肾毒性检测中呈阳性，表明其具有潜在的肾脏毒性风险。
**3.2 基于ProTox-3.0的毒理学分析**
ProTox 3.0预测CPF的口服半数致死剂量（LD
50）为60 mg/kg，属毒性3级（中等毒性）。毒性关联网络显示CPF与肾毒性（nephrotoxicity）、芳烃受体（AhR）、细胞色素CYP3A4、线粒体膜电位（MMP）等密切相关；毒性雷达图揭示CPF在CYP2E1诱导、MMP扰动、AhR激活等终点得分高于数据库平均值。
**3.3 与CPF诱导肾损伤相关的综合靶点筛选与功能富集分析**
共获得353个CPF潜在靶点和1,453个肾损伤相关靶点，交集得到33个重叠靶点。GO富集分析显示，这些靶点在生物学过程（BP）中显著富集于活性氧代谢过程、脂多糖反应等；分子功能（MF）富集于血红素结合、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）结合等；细胞组分（CC）富集于质膜外侧面和氧化还原酶复合物。KEGG通路富集于脂质与动脉粥样硬化、HIF-1信号通路、过氧化物酶体等。
**3.4 PPI网络构建与核心靶点识别**
利用STRING数据库构建33个重叠靶点的PPI网络，通过五种算法（Degree、EPC、MCC、MNC、MCODE）取交集，最终确定7个共享核心靶点：MPO、NFE2L2、NOS2、NOS3、SOD2、TLR4和XDH。
**3.5 候选基因的功能富集与调控网络分析**
Metascape分析显示核心基因主要富集于活性氧代谢过程、一氧化氮生物合成过程、氧化应激响应等。模块网络分析发现NOS2与NOS3构成的小相互作用模块。疾病关联分析显示这些基因与缺血再灌注损伤、糖尿病、急性肾损伤等相关，且主要在肺树突状细胞中表达。上游调控网络预测转录因子JUN、RELA、NFKB1和SP1可能介导这些应激相关信号通路的转录激活。
**3.6 分子对接验证核心靶点**
分子对接结果显示CPF与XDH的结合能力最强（结合能-6.45 kcal/mol），与MPO、NOS2、NOS3等也表现出中等结合强度；CPF-oxon与MPO、XDH、NOS2相互作用较强；TCP虽为终末代谢物，仍能与MPO、XDH和NOS3形成稳定复合物。二维相互作用分析显示氢键、疏水作用和π-π堆积是主要结合力。
**3.7 比较分子动力学分析**
对7个靶蛋白与3种配体（CPF、CPF-oxon、TCP）进行100 ns MD模拟，所有系统均达到稳定收敛。CPF-oxon和TCP复合物的平均均方根偏差（RMSD）低于CPF，表明结合更紧密。氢键分析显示CPF-oxon和TCP形成更稳定持久的氢键网络。结合自由能计算表明CPF-oxon在大多数靶标中表现出更有利的相互作用能。残基波动（RMSF）分析显示配体结合区域灵活性降低。
**3.8 CPF上调MPO表达并介导HK-2细胞毒性**
CCK-8结果显示CPF呈浓度依赖性降低HK-2细胞活力，20 μM时活力降至75.5%，后续采用该浓度。RT-qPCR和Western blot证实CPF显著上调MPO的mRNA和蛋白水平。siRNA敲低MPO后，细胞活力显著恢复，形态改善，MPO表达下降，表明MPO介导了CPF的细胞毒性。
**3.9 MPO敲低减轻CPF诱导的氧化应激、炎症反应并调节PHD2/HIF-1α/VEGF通路**
CPF处理组（RI-CPF）SOD活性显著降低、MDA含量升高；MPO敲低后（RI-CPF+siMPO组）SOD活性回升、MDA下降。RT-qPCR显示CPF上调TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表达，MPO敲低后这些炎症因子表达显著下降。Western blot显示CPF上调PHD2、HIF-1α、VEGF蛋白水平，MPO敲低后这些蛋白表达降低。
讨论部分总结了研究的主要发现：CPF通过干扰跨膜转运、诱导氧化应激和炎症反应，上调MPO表达，激活HIF-1α/VEGF通路，进而导致肾小管损伤。研究通过多层次策略明确了MPO、XDH、SOD2、NFE2L2、TLR4、NOS2和NOS3等核心靶点，体现了CPF毒性的多靶点特征。这些发现为理解CPF肾毒性提供了分子基础，并为环境风险评估和靶向干预策略提供了理论依据。研究结论部分翻译如下：总之，本研究采用整合网络毒理学、分子对接、分子动力学模拟和细胞实验的策略，系统研究了CPF诱导的肾毒性。结果表明，CPF暴露通过破坏跨膜转运和诱导氧化应激引起肾小管损伤。关键的是，细胞实验显示CPF显著上调HK-2细胞中MPO的表达，而MPO敲低有效减轻了CPF诱导的氧化损伤、炎症反应和细胞损伤。鉴定出的核心靶点包括MPO、XDH、SOD2、NFE2L2、TLR4、NOS2和NOS3，共同体现了CPF毒性的多靶点特征。这些发现为理解CPF肾毒性建立了分子基础，并为针对农药诱导肾损伤的环境风险评估和靶向干预策略提供了有价值的见解。
