口服自组装纳米乳液驱动体内肝星状细胞靶向药物递送治疗肝纤维化

《Drug Delivery》：Oral self-assembly nanoemulsion drives in vivo hepatic stellate cell-targeting drug delivery in liver fibrosis

　　

肝纤维化是一种需要长期治疗的慢性肝病，其特征是细胞外基质（ECM）的过度积累，而ECM主要由活化的肝星状细胞（aHSCs）产生。口服给药是一种非侵入性且对长期治疗至关重要的策略。然而，由于纳米颗粒在肠道转运过程中易发生结构破坏，通过口服途径实现靶向aHSCs的药物递送仍面临重大挑战。为解决这一问题，研究人员制备了一种口服维生素A（VA）功能化的自纳米乳化药物递送系统（称为VA-SNEDDS），用于将桑色素（MOR）精准递送至aHSCs以治疗肝纤维化。口服给药后，设计的VA-SNEDDS在保持纳米乳液结构完整性的同时成功穿越肠上皮，通过淋巴途径进入体循环，并最终通过VA和视黄醇结合蛋白受体介导的结合在纤维化肝脏的aHSCs中蓄积。在四氯化碳（CCl₄）诱导的纤维化大鼠模型中，负载MOR的VA-SNEDDS治疗通过减少ECM沉积、羟脯氨酸含量和转化生长因子-β1（TGF-β1）表达，同时恢复肝功能，显著减轻了肝纤维化。该研究提供了一种具有高转胞吞效率的可口服的aHSCs靶向平台，并表明该策略在肝纤维化治疗中的潜力。

肝纤维化是一种以细胞外基质（ECM）过度沉积为特征的慢性肝病，活化的肝星状细胞（aHSCs）是其关键驱动因素。口服给药虽为非侵入性长期治疗策略，但纳米颗粒在胃肠道易降解失活，且难以实现aHSCs的选择性靶向。本研究旨在开发一种口服维生素A（VA）功能化的自纳米乳化药物递送系统（VA-SNEDDS），负载桑色素（MOR），通过淋巴途径吸收并靶向aHSCs，从而治疗肝纤维化。研究人员通过处方筛选制备了MOR-VA-SNEDDS，在健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（来源：成都达硕实验动物有限公司）中建立CCl₄诱导的肝纤维化模型。主要技术方法包括：透射电镜（TEM）和激光粒度分析仪表征纳米乳液形态与粒径；傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析药物相容性；高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）测定药物含量与血浆浓度；Caco-2细胞单层模型评估跨肠上皮转运；共聚焦显微镜和流式细胞术检测细胞摄取、凋亡及纤维化标志物（α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原）表达；活体成像和免疫荧光染色评估体内肝脏靶向与细胞定位；ELISA检测肝功能指标（ALT、AST、ALB）及肝纤维化标志物（羟脯氨酸（HYP）、TGF-β1）。这些方法系统验证了VA-SNEDDS的口服吸收机制、靶向效率及抗纤维化疗效。

研究结果：

**表征与稳定性（Characterization of MOR-VA-SNEDDS）**：透射电镜显示MOR-VA-SNEDDS形成近球形液滴，平均粒径28.24 nm，zeta电位?5.48 mV，包封率98.51%。体外释放实验表明，MOR-VA-SNEDDS在12 h内释放约65%药物，比游离MOR溶液更慢。傅里叶变换红外光谱证实药物与辅料相容。在胃、肠、肝组织匀浆中，MOR-VA-SNEDDS显著提高MOR稳定性，在肠匀浆中6 h后药物含量仅下降27.7%，而游离MOR降解达57%。

**体外抗纤维化效应（In vitro antifibrotic effect of MOR-VA-SNEDDS）**：
- *在HSC-T6细胞中的作用*：共聚焦显微镜显示，DiD标记的VA-SNEDDS在转化生长因子-β（TGF-β）活化的HSC-T6细胞中内吞效率显著高于未修饰的SNEDDS。蛋白质印迹（WB）分析表明，MOR-VA-SNEDDS处理显著降低α-SMA和I型胶原表达（p<0.05）。流式细胞术检测凋亡率显示，MOR-VA-SNEDDS组凋亡率为20.88%，显著高于游离MOR组（8.84%）和空白VA-SNEDDS组（3.62%）（p<0.001）。
- *靶向aHSCs的能力*：竞争性摄取抑制实验表明，原代大鼠HSC对DiD-VA-SNEDDS的摄取可被游离VA或视黄醇结合蛋白4（RBP4）预孵育显著抑制（p<0.001），证实VA-SNEDDS通过VA和RBP受体介导机制靶向aHSCs。
- *在原代大鼠HSC中的作用*：共聚焦和流式细胞术结果与HSC-T6细胞一致，MOR-VA-SNEDDS处理后原代HSC凋亡率达18.75%，高于MOR-SNEDDS（12.66%）和游离MOR（9.57%）（p<0.01）。

**口服吸收机制（Oral absorption mechanism of VA-SNEDDS）**：
- *细胞毒性*：MTT法显示MOR-VA-SNEDDS在1–50 μg/mL浓度范围内对Caco-2细胞无明显毒性（存活率>80%）。
- *跨Caco-2细胞单层转运*：使用双荧光染料DiO/DiI标记的VA-SNEDDS，共聚焦显微镜观察到在顶侧和基底侧均存在荧光共定位，表明纳米颗粒以完整结构跨膜转运。透射电镜进一步证实基底侧具有约50 nm的球形液滴，提示结构完整且发生尺寸变化。
- *纳米-生物自组装过程*：蛋白质印迹检测到基底侧缓冲液中存在载脂蛋白B-48（ApoB-48）信号，表明VA-SNEDDS在细胞内与内源性脂蛋白组装后以乳糜微粒（CMs）形式分泌。
- *对屏障功能的影响*：转运实验后荧光素钠渗透实验显示，MOR-VA-SNEDDS组的表观渗透系数（Papp）为6.43×10^?7 cm/s，低于阈值1×10^?6 cm/s，说明细胞单层屏障未受损。
- *血浆定位*：大鼠口服DiO/DiI共标记的VA-SNEDDS后，血液中观察到红绿荧光共定位，而分别给予单独标记的混合物则无共定位，证实纳米颗粒在血液循环中保持完整结构。

**体内肝脏靶向与细胞定位（In vivo hepatic targeting and cellular localization of VA-SNEDDS）**：活体成像显示，口服DiD-VA-SNEDDS后6 h肝脏荧光最强，其平均辐射效率是游离DiD组的6.9倍。离体器官成像进一步证实肝脏蓄积最高。免疫荧光染色显示，DiD信号在纤维化肝脏中与aHSCs标志物血小板衍生生长因子受体-β（PDGFR-β）共定位，且VA-SNEDDS的重叠区域大于未修饰SNEDDS，表明VA修饰增强了对aHSCs的靶向性。

**药代动力学行为（Pharmacokinetic behavior of MOR-VA-SNEDDS）**：荧光显微镜观察显示VA-SNEDDS主要在空肠吸收。药代动力学参数显示，MOR-VA-SNEDDS的峰值浓度（Cmax）为3279.59 μg/L，是MOR悬浮组的11.30倍；AUC_0-t为171.00 mg/L·min，显著高于MOR组（33.80 mg/L·min）（p<0.001）。使用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺（CYC）后，MOR-VA-SNEDDS的Cmax降低34.84%，AUC_0-t降低35.67%，证实淋巴途径在口服吸收中起关键作用。

**体内生物分布（In vivo biodistribution of MOR-VA-SNEDDS）**：LC-MS/MS测定口服后30 min主要器官中的MOR浓度。MOR-VA-SNEDDS组肝脏浓度为88.29 ng/mg，分别是MOR悬浮组和MOR-SNEDDS组的7.28倍和2.00倍，表明具有优异的肝脏靶向能力。

**抗纤维化活性（Antifibrotic activity of MOR-VA-SNEDDS）**：在CCl₄诱导的肝纤维化大鼠模型中，MOR-VA-SNEDDS治疗4周后，H&E和Masson染色显示肝小叶结构改善，胶原沉积显著减少（Ishak评分由4降低至1）。血清肝功能指标ALT、AST显著降低，ALB升高，均接近正常水平（p<0.001）。肝脏羟脯氨酸（HYP）和TGF-β1浓度也显著降低至接近正常值（p<0.001）。这些结果表明MOR-VA-SNEDDS能有效逆转肝纤维化进程。

**讨论与结论**：在讨论中，研究人员指出VA-SNEDDS通过模拟乳糜微粒的淋巴途径吸收，避免了肝脏首过代谢；同时，VA修饰利用aHSCs表面高表达的视黄醇结合蛋白受体及其他VA结合蛋白实现精准靶向。该纳米系统在保护药物免受胃肠道降解的同时，成功实现了口服给药后从肠道到肝脏aHSCs的完整跨细胞转运。结论部分原文翻译如下：在本研究中，研究人员成功开发了一种口服维生素A功能化的自组装纳米乳液，用于将桑色素靶向递送至肝纤维化中的活化肝星状细胞。MOR-VA-SNEDDS有效克服了肠道降解的挑战，显示出高效的跨肠上皮转运，随后通过淋巴途径进入体循环。该递送系统通过视黄醇结合蛋白受体介导的途径以及VA与细胞膜上其他VA结合蛋白的直接相互作用，实现了在纤维化肝脏中aHSCs的精准蓄积。在CCl₄诱导的肝纤维化大鼠模型中，MOR-VA-SNEDDS表现出强效的抗纤维化活性，显著减少了ECM沉积、降低了羟脯氨酸和TGF-β₁水平，并恢复了肝功能。这些发现强调了这种口服递送的aHSCs靶向平台的高转胞吞效率和治疗潜力，作为肝纤维化长期治疗的一种有前景的策略。