《Drug Design, Development and Therapy》：Recent Advances in the Study of Traditional Chinese Medicine in Reversing Hepatic Fibrosis Through the Regulation of Hepatic Stellate Cells Apoptosis Pathways
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肝纤维化（HF）是一种病理表现，其中肝星状细胞（HSCs）被炎症刺激激活并产生过量细胞外基质（ECM），导致肝内胶原过度沉积。作为肝纤维化的核心效应细胞，肝星状细胞具有多种细胞状态，包括静止、活化和静止样功能障碍状态。在肝纤维化中，它们可通过在不同状态下激活多
肝纤维化（HF）是一种病理表现，其中肝星状细胞（HSCs）被炎症刺激激活并产生过量细胞外基质（ECM），导致肝内胶原过度沉积。作为肝纤维化的核心效应细胞，肝星状细胞具有多种细胞状态，包括静止、活化和静止样功能障碍状态。在肝纤维化中，它们可通过在不同状态下激活多条相关信号通路，发挥促炎效应、强增殖、维持永久活化状态以及抵抗细胞死亡等功能。因此，诱导肝星状细胞的多重死亡通路并恢复其功能障碍、静止和衰老状态，对于抑制肝纤维化至关重要。中药活性成分和复方制剂在治疗肝纤维化方面具有多通路作用和代谢负担低等优势，且在调节肝星状细胞死亡和逆转肝纤维化的研究中取得了显著进展，但仍存在挑战，如识别特定活性成分、阐明机制以及改进实验模型以更好地模拟肝脏的多细胞环境。
**不同状态的肝星状细胞在肝纤维化中的作用**
**静止状态 - 肝星状细胞**：肝星状细胞（HSCs）位于肝窦内皮细胞和肝细胞之间，正常条件下占肝细胞总数的10%-15%，呈现静止、非增殖的表型（静止肝星状细胞，qHSCs），主要功能是以视黄酯形式储存视黄醇于胞质脂滴（LDs）中，维持细胞外基质（ECM）稳态和肝细胞增殖，支持肝脏生理功能。
**活化状态 - 肝星状细胞**：当刺激到达肝脏时，肝细胞损伤产生损伤相关分子模式，与巨噬细胞共同激活炎症信号通路（如Toll样受体4/核因子-κB，TLR4/NF-κB），释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β1（TGF-β1）等炎症介质，建立初始炎症环境。随后，这些因子与巨噬细胞释放的趋化因子共同作用，诱导qHSCs向损伤部位迁移，消耗脂滴（LDs）获取能量，启动活化并转化为活化肝星状细胞（aHSCs）。aHSCs向肌成纤维细胞样细胞表型转变，分泌ECM成分如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），持续产生炎症因子放大炎症反应，同时表现出强增殖和抗凋亡特性，形成“HSCs活化-增殖-纤维化”的正反馈循环，标志肝纤维化（HF）正式开始。
**活化与增殖：TGF-β/Smad和PDGF**：TGF-β/Smad信号通路是纤维化研究的核心通路之一。肝损伤时，大量TGF-β1分泌，与HSCs表面受体结合，促进细胞内Smad2/3蛋白磷酸化，驱动qHSCs向aHSCs转化并启动HF。同时，肝脏进行血管修复以恢复血流，血小板衍生生长因子（PDGF）等修复因子与HSCs表面受体（包括PDGF受体β）相互作用，不仅激活HSCs，还刺激其增殖并增强促纤维化能力。
**抗凋亡与炎症放大：TLR4/NF-κB/BCL-2/Caspase信号通路**：TNF-α和白介素家族成员等炎症因子与qHSCs表面受体结合，依次激活细胞内核因子-κB（NF-κB）。活化的NF-κB入核调控转录，上调抗凋亡基因B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2），并调节半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases），控制凋亡执行，使aHSCs获得抗凋亡表型，并通过正反馈分泌炎症因子，放大炎症反应，加速HF进展。研究表明，NF-κB表达增加与Bcl-2表达正相关，导致aHSCs凋亡显著减少；反之，抑制NF-κB表达可诱导aHSCs核固缩和碎裂，凋亡率显著增加，从而逆转HF。
**肝星状细胞的凋亡**
**凋亡与坏死性凋亡**：凋亡是自发的程序性细胞死亡，生理条件下仅占HSCs死亡的少数。肝损伤时，HSCs的内源性和外源性凋亡通路均被激活和增强。常见外源性凋亡激活因子包括TNF-α和凋亡配体，与相应受体结合后形成复合物I，随后解离并与胞质死亡受体结构域、caspase 8和受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）形成复合物II，识别终末凋亡效应信号caspase-3/7，启动caspase级联反应，导致细胞收缩、染色质碎裂、细胞膜出泡并形成凋亡小体。内源性凋亡主要通过线粒体途径发生，细胞损伤（如DNA损伤或活性氧（ROS）积累诱导的氧化应激）影响线粒体外膜，导致结构损伤，释放细胞色素c等因子，通过caspase-9激活线粒体凋亡通路，进一步放大凋亡，持续诱导aHSCs凋亡。
**坏死性凋亡**：坏死性凋亡是一种结合坏死“细胞膜破裂”特征与凋亡程序性调控特征的新型细胞死亡形式，主要发生在炎症水平较高的器官。肝损伤以持续炎症为特征，炎症介质浓度不断增加，导致HSCs持续发生坏死性凋亡。与外源性凋亡通路类似，坏死性凋亡涉及复合物I的形成，随后从膜上解离形成复合物II。在此过程中，RIPK1与RIPK3相互作用，导致其磷酸化激活，活化的RIPK3特异性结合混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL），形成新的RIPK1/RIPK3/MLKL复合物，启动坏死性凋亡。研究表明，RIPK3和MLKL是坏死性凋亡的核心因子，在线粒体代谢通路调控中起关键作用，线粒体ROS引导成孔蛋白结合线粒体膜，形成线粒体孔释放ROS，促进HSCs向RIPK3/MLKL依赖的坏死性凋亡转变，诱导HSCs坏死性凋亡状态表达。
**自噬：AMPK/mTOR脂噬轴**：HSCs含有大量脂滴（LDs），在活化和转分化为肌成纤维细胞过程中，利用自噬通路降解LDs以获取能量，此过程称为HSCs中的脂噬（lipophagy）。自噬是一种细胞自我消化形式，溶酶体降解细胞内代谢物，维持肝脏微环境稳态。HSCs自噬调控具有阶段特异性和双向性：HF早期，脂噬促进qHSCs中LDs降解，消耗维生素A类物质，LDs消失是区分HSCs活化状态的关键标志；但随着HF进展，脂噬产生的代谢产物可能超过生理阈值，导致线粒体中ROS、亚铁离子（Fe2?）等标志物积累，触发多种HSCs死亡形式，抑制HF进展。脂噬在主要能量调控通路AMPK/mTOR激活下启动。AMP激活蛋白激酶（AMPK）调控细胞能量代谢，在ATP水平变化时被激活，促进自噬；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制自噬。通路激活后，UNC-51样激酶1（ULK1）复合物上调，招募自噬相关蛋白9（ATG9）至内质网（ER）区域，激活III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3KIII）复合物，促进新自噬体或自噬囊泡成核，囊泡从ER表面脱落，增加磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）产生，启动蛋白招募至自噬囊泡。随后微管相关蛋白1轻链3（LC3）与自噬囊泡相互作用，转化为膜结合型LC3-II，导致自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解利用LDs，生成ATP为HSCs活化供能，同时在线粒体和胞质中积累代谢废物。研究表明，抑制aHSCs中AMPK/mTOR表达时，PDGF等生长因子释放减少，aHSCs活化和增殖受限，从而缓解HF。总之，抑制aHSCs脂噬可限制HSCs活化的能量供应，减少活化细胞数量，有助于缓解HF。
**铁死亡：铁代谢-线粒体功能障碍**：肝脏是铁代谢关键器官，线粒体含量最高。铁死亡是一种独特的调节性细胞死亡形式，常由aHSCs中铁代谢紊乱、脂质过氧化失衡和线粒体功能障碍等通路触发。核受体共激活因子4（NCOA4）是铁死亡关键蛋白，能与铁蛋白结合，其LC3相互作用区域与自噬体膜上的LC3结合，导致铁蛋白降解并释放大量Fe2?，引起“铁池超载”，导致ROS积累和脂质氢过氧化物（LOOH）形成。正常情况下，细胞内谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）利用谷胱甘肽还原LOOH为无毒脂醇，但Fe2?持续生成使LOOH形成速率远超GPX4清除能力，且Fe2?抑制GPX4活性，削弱其抗氧化功能，促进不受控制的脂质过氧化，最终诱导aHSCs铁死亡，缓解HF。
**功能障碍、静止样和衰老状态**：aHSCs功能障碍指其无法分化或恢复为静止或衰老状态，这是除诱导死亡外限制aHSCs功能的另一种方式。但具体蛋白靶点和调控通路尚不明确，多数研究集中于转录因子和基因。研究表明，前B细胞白血病转录因子1（PBX1）和白介素-7受体（IL-7R）是HSCs活化的关键转录因子，降低其表达可抑制HSCs向肌成纤维细胞转分化并减轻HF严重程度；Brahma相关基因1（BAG1）在HSCs分化过程中表达显著增加，抑制其表达可明显改善小鼠HF和aHSCs分化状态。这些实验结果提示，aHSCs分化的功能障碍以及恢复静止或衰老样状态可能是一种有前景的逆转HF治疗策略。
**中药通过靶向肝星状细胞防治肝纤维化**
**中药活性成分通过HSCs调节肝纤维化**
**黄酮类**：银杏双黄酮（Ginkgetin）是从银杏叶中提取的双黄酮类化合物，具有抗炎和调节脂质代谢作用。Wang等在人体HSCs（LX-2）和原代小鼠HSCs中发现，银杏双黄酮显著降低HSCs活力，抑制α-SMA和Bcl-2表达，呈剂量依赖性诱导凋亡，提示其可能通过促进HSCs凋亡、减少ECM沉积来缓解HF。木犀草素（Luteolin）是金银花和黄芩中的关键生物活性成分，在HF小鼠和HSCs自噬研究中显示，小鼠肝脏和HSCs中自噬体数量显著减少，HSCs活化受抑，ECM成分表达降低，HF严重程度减轻，提示木犀草素可能通过促进HSCs自噬逆转HF。Zhou等通过HSCs铁代谢模型体外和体内联合研究发现，苦参总黄酮处理后，HSCs增殖和存活率显著降低，肝脏和aHSCs中ROS和转铁蛋白受体水平下降，胶原沉积明显减少，提示苦参总黄酮可能通过调节HSCs铁死亡和氧化应激逆转HF。
**萜类**：莪术醇（Curcumol）是莪术中提取的倍半萜活性成分，具有抗炎和保肝作用。莪术醇通过诱导自噬和铁死亡抑制HSCs-T6增殖，下调Bcl-2和α-SMA水平，增加caspase 3表达，同时HSCs-T6线粒体显著肿胀、嵴破坏、膜电位降低，自噬体形成增加，凋亡率提高，提示莪术醇可能通过诱导线粒体自噬并促进aHSCs死亡逆转HF。紫苏醛（Perillaldehyde）是紫苏变种的活性成分，具有抗炎和利胆作用。在HF小鼠和活化的LX-2细胞研究中，它显著减少小鼠肝组织胶原积累，抑制LX-2迁移和增殖能力，并抑制Smad2/3表达，提示紫苏醛可能通过调节TGF-β/Smad信号通路，抑制HSCs活化和增殖逆转HF。黄芪甲苷IV（Astragaloside IV）是黄芪中的重要萜类活性成分，具有抗炎和抗纤维化等多种药理活性。Tian等在HSCs-T6氧化应激模型中证明，黄芪甲苷IV可降低HSCs-T6的活化和存活率，抑制ECM分泌及ROS相关蛋白表达，提示其可能通过调节氧化应激、抑制HSCs活化并促进其死亡来缓解HF。
**其他成分**：黄精（Polygonatum sibirica）可降低血脂水平并治疗慢性肝炎，多糖被认为是关键生物活性成分。Shen等在PDGF诱导的LX-2细胞凋亡模型中观察到，LX-2细胞生长面积减小，ECM成分和抗凋亡蛋白表达降低，caspase3/8/9水平升高，提示黄精多糖可能促进aHSCs凋亡并缓解HF。欧前胡素（Holarrhena）是从白芷中提取的香豆素类化合物，具有抗炎和抗纤维化作用。在TGF-β1诱导的LX-2活化研究中，它显著降低LX-2细胞活力和增殖，诱导其向静止样状态转变，抑制α-SMA和PDGF受体表达，提示抑制HSCs活化和增殖可能缓解HF。这些研究表明，中药成分主要通过减轻炎症、抑制aHSCs活化和增殖、诱导多种细胞死亡形式来缓解HF。
**中药复方通过肝星状细胞调节肝纤维化**
**芪参汤**：由黄芪、党参（或人参）、白术、茯苓、当归、川芎、丹参、赤芍、甘草组成，是临床治疗HF的经验方。Yang等在树突状细胞、HSCs和CD4?辅助性T淋巴细胞共培养研究中发现，芪参汤抑制NF-κB表达，降低树突状细胞表型阳性细胞比例，显著增加CD4?辅助性T淋巴细胞表达，提高aHSCs凋亡率并减少ECM沉积，提示芪参汤可能通过抑制树突状细胞成熟分化、调节免疫平衡、抑制炎症反应以及抑制aHSCs增殖和活化来逆转HF。
**清肝益脾方**：由柴胡、白芍、当归、白术、茯苓、甘草、薄荷（后下）、栀子组成，具有清热解毒、增强免疫力作用，临床可有效改善HF。Liu通过网络药理学筛选，在HSCs-T6细胞体外和体内研究中发现，该方剂能抑制大鼠肝脏和aHSCs中TLR4/NF-κB通路的激活，减轻肝脏炎症浸润，降低aHSCs增殖和活化率，提示清肝益脾方可能通过抑制肝脏TLR4/NF-κB信号通路、减少炎症浸润和HSCs活化、降低ECM分泌来逆转HF。
**加味桃核承气汤**：由桃仁、大黄、桂枝、芒硝、甘草组成，并加味丹参、赤芍、牛膝、川芎，是破瘀、理气、消积的经典中药方，常用于临床治疗HF和肝硬化。在HF模型体外和体内联合研究中发现，肝脏ECM沉积减轻，自噬相关蛋白如过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）和LC3表达受抑，HSCs脂滴降解减少，活化率降低，提示该方可能通过影响HSCs自噬、降低脂质积累并抑制HSCs活化和增殖来逆转HF。
**其他复方**：扶正化瘀汤（由黄芪、丹参、桃仁、赤芍、虫草、五味子组成）和复方鳖甲软肝片（由鳖甲、丹参、三七、莪术、当归、白芍、黄芪、党参、茯苓、甘草组成）常作为阳性对照。研究发现扶正化瘀汤可能通过调节HSCs增殖和氧化应激、调控NF-κB和Smad信号通路表达来缓解HF；复方鳖甲软肝片降低HF模型大鼠肝纤维化程度，体外实验显示该方通过影响自噬相关蛋白表达抑制HSCs活化、减少ECM沉积并缓解HF。然而，这些证据也存在关键挑战：首先，许多中药化合物的靶点特异性问题突出，NF-κB和TGF-β/Smad等常见靶点是多细胞类型和器官中炎症和纤维化的普遍调控因子，观察到的HSCs效应可能包含更广泛、非特异性的作用，引起潜在脱靶效应担忧；其次，许多天然产物（如黄酮类和萜类）口服生物利用度低、药代动力学特性不佳，是转化为可行药物的重大障碍，多数研究依赖体外模型或动物腹腔注射，未能充分解决吸收、分布、代谢和排泄（ADME）问题；最后，许多研究方法学严谨性各异，单细胞系实验（如LX-2、HSC-T6）结果可能无法完全重现纤维化肝脏的复杂多细胞微环境。因此，未来研究应从描述性列举观察效应转向更审慎的评估框架，评估化合物不仅基于简单模型中的功效，还应考虑体内环境的机制合理性、成药性以及来自生理相关系统的证据。
**讨论与展望**：HSCs是HF发展的核心效应细胞，干预其活化、分泌和死亡通路是目前逆转HF的主要研究方向。中医药已广泛应用于HF治疗，可通过调控复杂信号通路预防HSCs介导的多细胞串扰和纤维化功能，同时减轻肝脏代谢应激以逆转HF。然而，中医药在HSCs研究中仍存在局限性：首先，由于中医药“临床先用、研究在后”的特点，多数研究缺乏对活性成分、机制和靶点的明确识别以及药物安全性评价；其次，HSCs作用复杂，但以往研究实验设计往往不充分，未能模拟肝脏内多细胞环境，多数研究集中于单一HSCs死亡体外实验，靶点和细胞死亡通路选择肤浅，主要旨在药效验证而非探索性研究。不过，近年HSCs研究趋势已转向多细胞共培养系统及体内外联合验证。为弥合有前景的临床前发现与临床转化之间的差距，未来研究必须采用更严谨和综合的方法：首先，急需超越简单的单培养模型，采用更生理相关的系统，如精密切割肝切片（PCLS）和包含肝细胞、库普弗细胞、肝窦内皮细胞与HSCs共培养的先进多细胞系统，以更好模拟肝脏微环境，评估化合物功效和特异性；其次，对最有前景的先导化合物（如具有多通路功效的莪术醇或木犀草素），必须进行严格的药代动力学和药效学（PK/PD）研究，包括口服生物利用度、组织分布、代谢稳定性和潜在毒性；第三，网络药理学应从筛选工具发展为系统验证的假设生成框架，多靶点相互作用预测后，需通过CRISPR-Cas9敲除、特异性通路抑制剂和空间转录组学等技术进行实验确认，以解读精确作用机制。最终目标是利用对中药化合物如何调节HSCs的深入机制理解，合理设计循证疗法，鉴定出不仅高效且具有良好成药性的化合物，从而将传统草药知识转化为靶向、安全、有效的抗纤维化药物。总之，HSCs是逆转HF的关键靶细胞，进一步深入研究其功能，并结合中医药治疗HF的独特优势，将为开发HF新药和有效治疗策略提供理论依据。
