R-α-硫辛酸(R-α-lipoic acid, R-ALA)通过减轻小鼠氧化应激、炎症反应及线粒体损伤缓解对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤

《Drug Design, Development and Therapy》：R-α-Lipoic Acid Attenuates Acetaminophen-Induced Acute Liver Injury by Reducing Oxidative Stress, Inflammation, and Mitochondrial Damage in Mice

　　

摘要 背景：对乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)过量是急性肝损伤的主要病因，常伴氧化应激、线粒体功能障碍、炎症及肝细胞毒性。R-α-硫辛酸(R-α-lipoic acid, R-ALA)是一种天然抗氧化剂及线粒体辅因子，对APAP所致肝损伤具保护作用。 目的：探讨R-ALA对小鼠APAP诱导急性肝损伤的保护效应。 方法：将成年雄性小鼠随机分为五组——对照组、APAP模型组、R-ALA单独给药组、重复R-ALA预处理+APAP组、单次R-ALA预处理+APAP组。APAP按500 mg/kg灌胃，R-ALA按100 mg/kg灌胃；重复预处理组连续给予R-ALA 10 d，单次预处理组在APAP前1 h给予R-ALA。APAP给药24 h后采集血清及肝组织。检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, GLDH)、高迁移率族框蛋白-1(high mobility group box-1, HMGB1)、细胞角蛋白-18(keratin-18, K18)、胱天蛋白酶剪切细胞角蛋白-18(caspase-cleaved keratin-18, ccK18)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)；检测肝组织丙二醛(malondialdehyde, MDA)、还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶3(glutathione peroxidase 3, GPx3)。 结果：APAP使血清肝细胞损伤、线粒体损伤、肝细胞死亡及炎症标志物(ALT、AST、GLDH、HMGB1、K18、ccK18、IL-6、TNF-α)升高，并使肝组织MDA升高，GSH、SOD、CAT、GPx3降低。R-ALA预处理显著逆转上述改变。APAP使血清ALT由7.49升至29.46 U/L，AST由11.10升至32.49 U/L，R-ALA预处理使二者较APAP模型组显著降低。 结论：R-ALA通过增强抗氧化防御、减轻氧化应激、抑制炎症反应、降低线粒体损伤标志物及肝细胞死亡标志物，缓解小鼠APAP致肝损伤生物标志物变化。其保护作用由抗氧化、抗炎及线粒体保护机制介导。尚需组织学及通路分子研究确认潜在机制及转化价值。

论文解读：R-ALA通过减轻氧化应激、炎症及线粒体损伤缓解APAP诱导的小鼠急性肝损伤

该研究发表于《Drug Design, Development and Therapy》。目前已知对乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)过量是美国急性肝衰竭的首要原因，其肝毒性源于细胞色素P450(CYP2E1/CYP3A4)代谢生成的毒性中间体N-乙酰基-对-苯醌亚胺(N-acetyl-p-benzoquinone imine, NAPQI)；大剂量APAP使NAPQI超出肝内还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)结合能力，导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)爆发、线粒体功能障碍、脂质过氧化及肝细胞坏死，并继发炎症级联反应。R-α-硫辛酸(R-α-lipoic acid, R-ALA)是α-硫辛酸的生物活性对映体，作为线粒体丙酮酸脱氢酶复合体辅因子及强效抗氧化剂，可清除ROS、再生GSH及维生素E、激活核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2–related factor 2, Nrf2)并抑制核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)通路，但其对APAP急性肝损伤中线粒体损伤、肝细胞凋亡及抗氧化酶系统的具体保护作用尚缺乏系统评价。为此，研究人员建立小鼠APAP急性肝损伤模型，设置对照、模型及不同R-ALA预处理方案，系统检测血清肝细胞/线粒体损伤标志物、凋亡标志物、炎性细胞因子及肝组织氧化应激/抗氧化指标，以明确R-ALA的肝保护效应及可能机制。

研究人员选用35只瑞士白化(Swiss albino)雄性成年小鼠(30–35 g)，随机分为5组(n=7)：对照组(给予玉米油溶媒)、APAP模型组(单次灌胃APAP 500 mg/kg)、R-ALA单独组(连续10 d灌胃R-ALA 100 mg/kg)、重复R-ALA预处理+APAP组(连续10 d灌胃R-ALA 100 mg/kg后给APAP 500 mg/kg)、单次R-ALA预处理+APAP组(APAP前1 h单次灌胃R-ALA 100 mg/kg)。APAP给药24 h后CO₂安乐死，采集血清及肝组织；血清用ELISA法检测ALT、AST、GLDH、HMGB1、K18、ccK18、IL-6、TNF-α；肝匀浆上清用ELISA法检测MDA、GSH、SOD、CAT、GPx3；数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)及Tukey多重比较检验，以p<0.05为差异有统计学意义。

Effect of R-ALA on APAP-Induced Hepatocellular Injury and Mitochondrial Injury Markers（R-ALA对APAP诱导的肝细胞损伤及线粒体损伤标志物的影响）

APAP使血清ALT(F(4,30)=130.3, p<0.0001)由7.49升至29.46 U/L，AST(F(4,30)=56.28, p<0.0001)由11.10升至32.49 U/L；线粒体标志物GLDH(F(4,30)=32.46, p<0.0001)及坏死/炎症相关核蛋白HMGB1(F(4,30)=45.46, p<0.0001)亦显著升高(p<0.0001 vs 对照)。R-ALA单独给药不影响ALT/AST基线；重复及单次R-ALA预处理均使ALT、AST、GLDH、HMGB1较APAP模型组显著降低(p<0.0001)，提示R-ALA可减轻APAP所致的肝细胞崩解及线粒体释放的损伤信号。

Effect of R-ALA on APAP-Induced Hepatocyte Death Markers（R-ALA对APAP诱导的肝细胞死亡标志物的影响）

APAP使血清上皮细胞分化/凋亡标志K18(F(4,30)=100.6, p<0.0001)及胱天蛋白酶3剪切的ccK18(F(4,30)=142.0, p<0.0001)较对照显著升高(p<0.0001)。重复与单次R-ALA预处理均使K18及ccK18较APAP模型组显著降低(p<0.0001)，表明R-ALA可抑制APAP诱发的caspase依赖性肝细胞凋亡。

Effect of R-ALA on APAP-Induced Inflammatory Cytokines（R-ALA对APAP诱导的炎性细胞因子的影响）

APAP使血清促炎因子IL-6(F(4,30)=58.04, p<0.0001)及TNF-α(F(4,30)=156.1, p<0.0001)较对照升高(p<0.0001)。重复与单次R-ALA预处理均使IL-6及TNF-α较APAP模型组显著降低(p<0.0001)，说明R-ALA可抑制APAP肝损伤继发的Kupffer细胞活化及炎症介质释放。

Effect of R-ALA on APAP-Induced Hepatic Oxidative Stress（R-ALA对APAP诱导的肝组织氧化应激的影响）

APAP使肝组织脂质过氧化产物MDA(F(4,30)=143.6, p<0.0001)升高，抗氧化底物GSH(F(4,30)=49.52, p<0.0001)耗竭(p<0.0001 vs 对照)。R-ALA单独给药即使肝GSH较对照升高(p=0.0417)；重复与单次R-ALA预处理均使MDA降低、GSH恢复至接近正常(p<0.0001 vs APAP组)，证实R-ALA提升肝内抗氧化储备并抑制NAPQI引发的脂质过氧化。

Effect of R-ALA on APAP-Induced Changes in Hepatic Antioxidant Enzymes（R-ALA对APAP诱导的肝抗氧化酶活性变化的影响）

APAP使肝SOD(F(4,30)=45.71, p<0.0001)、CAT(F(4,30)=32.21, p<0.0001)、GPx3(p<0.0001)活性较对照下降(p<0.0001)。重复与单次R-ALA预处理均使三种抗氧化酶较APAP模型组显著回升(p<0.0001)，表明R-ALA恢复肝细胞ROS清除酶系统的功能。重复与单次R-ALA预处理组间各指标无统计学差异。

讨论与结论总结

讨论指出，本研究在生化水平证实APAP致肝毒性伴随肝细胞酶泄漏(ALT/AST)、线粒体损伤(GLDH升高)、危险相关分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)蛋白HMGB1释放、caspase依赖凋亡(K18/ccK18)、促炎细胞因子(IL-6/TNF-α)上调及氧化还原失衡(MDA↑/GSH↓/SOD↓/CAT↓/GPx3↓)。R-ALA预处理通过抗氧化(降低MDA、提升并维持GSH、恢复SOD/CAT/GPx3)、抗炎(下调HMGB1、IL-6、TNF-α)及线粒体保护(降低GLDH)三重机制减轻上述改变；R-ALA单独给药亦可提升基础肝GSH水平。重复与单次预处理均有保护作用但无统计学优劣差异。研究局限包括缺组织病理学、缺Western blot/qPCR等分子通路验证、R-ALA为预处理而非解毒治疗、未与标准解毒剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)对照。

结论翻译：本研究表明，APAP急性给药通过升高肝损伤生物标志物、引发线粒体损伤、炎性反应、氧化应激及削弱抗氧化防御致小鼠显著肝损伤。R-ALA预处理通过降低升高的肝酶、抑制炎性细胞因子、减少脂质过氧化及恢复细胞内抗氧化剂，减轻APAP诱导的肝损伤。重复与单次R-ALA预处理较APAP单独处理均具显著保护作用，但重复预处理在统计学上并不优于单次预处理。综上，结果支持R-ALA对APAP肝损伤的潜在保护价值；仍需进一步研究明确其作用机制并确定最佳预防策略。