靶向KRASG12V新型强效肽的发现及其对结直肠癌细胞的抗增殖活性

《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Discovery of a novel and potent KRASG12V-targeting peptide with antiproliferative activity against colorectal cancer cells

　　

尽管KRAS^G12V在结直肠癌（colorectal cancer, CRC）中具有重要的临床意义，但KRAS^G12V特异性抑制剂仍然有限。研究人员通过基于结构的虚拟筛选方法，对一个包含59,319条序列的肽库进行筛选，鉴定出4条靶向KRAS^G12V的肽，其中肽-1（Peptide-1）显示出最有利的对接特征。微量热泳动（microscale thermophoresis, MST）实验证实，肽-1在肽1–4中具有最高的亲和力，且与KRAS^G12V的结合强于其他KRAS突变体。结构分析、分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟和自由能计算表明，肽-1通过广泛的氢键和疏水相互作用与KRAS^G12V形成稳定且能量上有利的复合物。肽-1表现出良好的人血清稳定性，并通过细胞NanoBRET实验证实其与KRAS^G12V存在相互作用。功能上，肽-1在结直肠癌细胞系中显示出强效的抗增殖活性，对正常细胞影响较弱，且在KRAS^G12V敲低后功效下降。在SW480细胞中，肽-1与ERK1/2磷酸化降低、p21上调及G₀/G₁期阻滞相关。总体而言，这些发现支持将肽-1作为KRAS^G12V靶向肽进行结直肠癌药物发现的进一步研究。

**研究背景与问题提出**

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球癌症相关发病率和死亡率的主要原因之一，造成沉重的公共卫生负担。克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, KRAS）作为关键的原癌基因，其突变可驱动CRC的肿瘤发生和进展。KRAS第12位密码子是突变热点，其中G12V（30%）、G12C（11–13%）和G12D（35%）是人类癌症中最常见的变异。尽管多种靶向KRAS^G12D的小分子和肽类抑制剂已被开发，但作为第二高频致癌KRAS突变体，KRAS^G12V仍作为治疗靶点研究不足。因此，开发KRAS^G12V靶向药物仍是亟待满足的重要需求。

KRAS属于RAS超家族的小GTP酶，调节增殖、存活和迁移等基本细胞过程。KRAS^G12V在结构和致癌功能上与KRAS^G12D存在显著差异：第12位缬氨酸（valine）替换产生明显的空间位阻和增强的疏水性，稳定了一种刚性、紧凑的蛋白构象，可能导致GTP水解受损及现有抑制剂的可配体性（ligandability）降低。相反，G12D中带极性负电荷的天冬氨酸为抑制剂结合提供了有利界面。KRAS^G12V还与细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）信号失调、p21/CDKN1A（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A）相关细胞周期调控改变及CRC进展相关。现有一系列针对KRAS^G12V突变癌症的研究性疗法，包括泛KRAS抑制剂、泛KRAS降解剂和KRAS^G12V选择性RNAi制剂，但大多数现有抑制剂对KRAS^G12V结合稳定性差，在细胞模型中抑制效果一般，迄无任何KRAS^G12V特异性抑制剂获批临床。小分子难以实现与KRAS^G12V的高亲和力结合，且KRASSemantics^G12V的结合界面平坦而广泛，妨碍小分子的有效结合。相比之下，肽类具有更大的结构灵活性，能够与KRAS^G12V结合界面更广泛地相互作用。

**主要技术方法**

研究人员采用基于分子对接的虚拟筛选策略，以H-REV107肽为参考对照，从59,319条序列的肽库中筛选靶向KRAS^G12V的候选肽。通过MST测定解离常数（Kd）评估结合亲和力；利用MD模拟评估复合物稳定性，结合自由能景观（free energy landscape, FEL）分析构象稳定性；采用人血清稳定性实验评估肽-1的体外稳定性。细胞功能实验包括：MTT法测定抗增殖活性；细胞NanoBRET靶点占据实验验证细胞内靶点结合；shRNA介导的KRAS^G12V敲除验证靶点依赖性；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测ERK1/2磷酸化；逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测ERK1和p21 mRNA表达；流式细胞术分析细胞周期分布。

**研究结果**

**基于对接的KRAS^G12V靶向肽筛选**：研究人员建立了整合计算筛选与实验验证的工作流程，包括分子对接、结合亲和力测定、结构-活性关系分析、MD模拟和体外细胞活性评估。对59,319条序列的肽库进行初步虚拟筛选后，选择排名前四的肽（肽1–4）及共晶参考肽H-REV107进行进一步评价。肽-1显示最低对接分数（?13.65 ± 0.77 kcal/mol），表明其与KRAS^G12V的预测结合最有利。

**结合验证及与对接预测的相关性**：MST测定GppNHp负载KRAS^G12V的Kd值显示，H-REV107的Kd为2.57 ± 0.14 μM，而肽1–4的Kd值较低（0.85–1.69 μM），其中肽-1的Kd最低（0.85 ± 0.03 μM），表明其与重组人KRAS^G12V蛋白结合亲和力最高。乱序肽（Scrambled peptide）的Kd > 10 μM，证实肽-1与KRAS^G12V的相互作用依赖于其特定的残基排列而非简单的氨基酸组成。对接分数与Kd值之间呈强正相关（R² = 0.9611），支持计算预测与实验 affinity 的一致性。选择性评估显示，肽-1对KRAS^G12D、KRAS^G12C、KRAS^G12A、KRAS^G12S、KRAS^G13D和KRAS^Q61H等突变体的Kd值均大于10 μM，提示其对KRAS^G12V具有优先结合特性。

**结构-活性关系分析**：分析显示，肽1–4均在KRAS^G12V活性口袋残基Gly13、Ala59、Gln61、Asn85、Asn86、Asp92和Lys117处形成氢键。肽-1和肽-4各自还与Tyr32和Tyr96形成额外氢键。肽-1与KRAS^G12V形成的氢键数量最多，支持其最强的整体相互作用。相互作用模式与观察到的结合亲和力趋势密切相关。

**KRAS^G12V-肽-1相互作用的MD分析**：50 ns MD模拟显示，KRAS^G12V-肽-1复合物在约5 ns后趋于稳定，均方根偏差（root mean square deviation, RMSD）维持在约0.2 nm；回转半径（radius of gyration, Rg）稳定在约1.56 nm；二级结构分析未发现异常转变；均方根涨落（root mean square fluctuation, RMSF）分析显示关键界面残基RMSF值低于0.1 nm，表明肽-1有效限制了结合位点周围的局部构象波动。能量分解显示Asp92、Asn85、Asn86、Gly13、Lys117和Tyr32等关键残基对结合自由能贡献显著，其中van der Waals相互作用提供主要稳定力，静电相互作用增强结合特异性。复合物维持稳定的氢键模式。

**KRAS^G12V-肽-1复合物的FEL分析**：基于RMSD和Rg构建的二维和三维自由能分布显示，全局最低能量点主要聚集于RMSD约0.15–0.20 nm、Rg约1.56–1.57 nm区域，表明模拟过程中存在稳定的优势构象，与RMSD和Rg值高度一致。

**肽-1的人血清稳定性**：肽-1在25%人血清中表现出适度的时间依赖性降解，90分钟内超过90%保持完整，360分钟后约80%残留，无明显的快速降解相，支持其进一步的细胞学评价。

**KRAS^G12V靶向肽的体外抗增殖效应**：MTT法测定显示，H-REV107的IC₅₀ > 10 μM，而肽1–4均显示更强的抗增殖活性。肽-1的IC₅₀为0.92 ± 0.04 μM，抑制效果最佳。乱序肽即使最高浓度（10 μM）也未达50%抑制，证实肽-1的生物学活性依赖于其特定氨基酸序列。结合自由能、结合亲和力和抗增殖活性的综合分析显示三者具有强整体一致性。细胞NanoBRET靶点占据实验显示，肽-1在SW480细胞中诱导浓度依赖性的标准化BRET信号降低，表观IC₅₀为1.91 ± 0.20 μM，支持其与KRAS^G12V的细胞内结合。肽-1对KRAS^G12V突变型SW620和SNU-C4细胞具有显著抗增殖活性（IC₅₀分别为1.06 ± 0.07 μM和1.27 ± 0.09 μM），但对KRAS^WT HT-29细胞无明显活性（IC₅₀ > 10 μM），对正常结肠上皮细胞NCM460的抑制作用也明显较弱（IC₅₀ > 10 μM）。

**肽-1抗增殖活性的KRAS^G12V依赖性**：在shRNA介导的KRAS^G12V敲低SW480细胞模型中，肽-1在shControl细胞中保持强效抑制活性（IC₅₀ = 0.92 ± 0.04 μM），而在shKRAS^G12V细胞中活性显著降低，证实其抗增殖效应与KRAS^G12V表达密切相关。

**肽-1相关的ERK信号和细胞周期分布变化**：ELISA检测显示，与表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）单独处理相比，EGF与肽-1共处理降低了ERK1/2磷酸化水平，且效果比阳性参考肽H-REV107更为明显。RT-qPCR分析显示肽-1处理下调ERK1 mRNA表达、上调p21 mRNA表达，呈浓度相关趋势。流式细胞术分析显示，随着肽-1浓度增加，G₀/G₁期细胞比例逐渐增加，S期和G₂/M期相应减少，提示肽-1可能与ERK相关信号变化、p21上调及G₀/G₁期细胞周期阻滞相关。

**讨论与结论**

该项研究发表在《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》。研究人员采用基于结构的虚拟筛选策略，从包含59,319条序列的肽库中鉴定出4条靶向KRAS^G12V的肽，其中肽-1表现出最有利的对接分数，提示其预测结合更优。MST实验验证了所有4条肽对活性态KRAS^G12V的增强结合亲和力，其中肽-1的相互作用最强。计算对接分数与MST衍生Kd值之间的一致性支持了该筛选流程用于KRAS^G12V结合肽优先排序的实用性，而MST选择性分析进一步提示肽-1在相同实验条件下可能优先与KRAS^G12V而非其他代表性KRAS突变体结合。

结构和分子动力学分析揭示，肽1–4之间结合亲和力的差异主要源于KRAS^G12V活性口袋内不同的氢键网络和疏水相互作用。肽-1与关键口袋残基形成了最广泛且稳定的相互作用界面，MD模拟支持KRAS^G12V-肽-1复合物在生理条件下的构象稳定性，表现为受限的残基波动、保持的结构紧密性以及相对于apo-KRAS^G12V明确定义的低能量自由能景观。能量分解强调了van der Waals力、静电相互作用和持久氢键对稳定高亲和力结合的协同贡献。

肽-1在人血清中表现出良好的体外稳定性，90分钟内保持超过90%的完整肽，360分钟后约80%残留，支持其用于细胞学评价的适用性。在细胞实验中，肽-1在SW480细胞中对肽1–4显示出最强的抗增殖活性，并在其他CRC细胞系中保持一致的活性，同时对正常结肠上皮细胞的抑制作用较弱。细胞NanoBRET分析支持肽-1在SW480细胞内与KRAS^G12V的结合。此外，肽-1在SW480细胞中表现出KRAS^G谁知关联的抗增殖活性，无明显的非特异性细胞毒性。肽-1处理与EGF诱导的ERK1/2磷酸化降低、ERK1下调、p21上调和G₀/G₁期细胞周期增加相关。

研究结论指出，肽-1在CRC细胞中表现出可观的抗增殖活性，这可能与其KRAS^G12V细胞内靶点结合、ERK相关信号改变及细胞周期分布改变相关。这些发现支持将肽-1作为KRAS^G12V靶向肽进行结直肠癌药物发现的进一步研究。