影响CD3 T细胞衔接器安全性评估的物种差异

《Journal of Immunotoxicology》：Species differences influencing the safety assessment of CD3 T-cell engagers

　　

双特异性CD3 T细胞衔接器（T-cell engagers，TCE）可将内源性T细胞重定向至肿瘤细胞，并已显示出显著的临床活性，但其作用机制也会驱动免疫介导的毒性，而这类毒性在非人灵长类（nonhuman primate，NHP）研究中往往被低估。为探究这一转化鸿沟的生物学基础，研究人员采用免疫表型分析、基于TCE的功能表征以及单细胞转录组学（single-cell transcriptomics）分析，对人和食蟹猕猴T细胞进行了比较评估。人和NHP供体在T细胞频率、亚群分布以及对多克隆刺激的强应答方面总体相似，证实两种物种均保留了内在效应功能。然而，在多种靶向CD20、B细胞成熟抗原（B-cell maturation antigen，BCMA）和G蛋白偶联受体家族C组5成员D（GPRC5D）的TCE条件下，人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）始终表现出更高的细胞毒效力，并且相较于NHP产生显著更高水平的干扰素γ（interferon γ，IFNγ）。转录组分析显示，尽管T细胞受体（T-cell receptor，TCR）信号传导的整体架构在不同物种间是保守的，但人T细胞中某些近端信号介质的表达更高，包括连接子活化T细胞衔接蛋白（LAT）、磷蛋白相关糖鞘微区蛋白1（PAG1）、S期激酶相关蛋白1（SKP1）以及磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）家族基因。这些功能性与分子层面的差异，为NHP毒理学研究中观察到的药理学反应性降低提供了机制性解释。尽管NHP研究在识别抗原依赖性细胞毒性风险方面能够提供有价值的信息，但其局限性也进一步凸显了在非临床安全性评估中纳入与人体更相关模型的重要性。

该文发表于《Journal of Immunotoxicology》，聚焦于CD3 T细胞衔接器（T-cell engager，TCE）非临床安全性评价中的关键转化问题，即非人灵长类（nonhuman primate，NHP）模型为何常常低估人体中由T细胞激活所致的免疫毒性。TCE通过同时结合T细胞表面的CD3与肿瘤相关抗原，诱导免疫突触形成并激活细胞毒效应，因此在血液系统恶性肿瘤乃至实体瘤治疗中展现出重要前景。然而，这一机制也伴随着细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（immune-effector-cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS）、输注相关反应及靶向/脱靶组织损伤等风险。既往药理与毒理经验显示，NHP虽被长期视为生物药相关性物种，但对TCE诱导的细胞因子风暴及炎症毒性预测不足，导致临床前安全性外推存在明显偏差。因此，阐明人和NHP在T细胞激活反应上的物种差异，对于优化首次人体给药剂量（first-in-human，FIH）推算和完善免疫毒理学（immunotoxicology）评估框架具有直接意义。

为回答这一问题，研究人员围绕人源与食蟹猕猴T细胞开展了多层次比较研究。结果表明，两物种在基础T细胞构成与对非特异性强刺激的反应能力方面并无本质缺陷差异，提示NHP并非普遍缺乏T细胞效应功能；但在TCE介导的特异性CD3激活场景下，人源细胞表现出更强的细胞毒作用和更高的促炎细胞因子释放。进一步的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）结果显示，这种功能差异与T细胞受体（T-cell receptor，TCR）近端信号分子表达增强有关。研究据此提出，NHP模型在评估TCE的抗原依赖性杀伤风险方面仍有价值，但对细胞因子介导毒性的预测能力有限，非临床安全评价应更多整合人相关新方法学（new approach methodologies，NAMs）与体外人源模型。这一结论对于TCE类药物的转化安全评价、剂量设计以及物种选择策略具有重要现实意义。

研究人员采用的主要技术方法包括：选取10例健康成人供体和10只健康成年食蟹猕猴供体来源的冷冻外周血单个核细胞（PBMC），以流式细胞术进行免疫表型分析，比较CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺及CCR7、CD45RA相关记忆/初始亚群分布；以PMA/离子霉素刺激评估多克隆激活下的IFNγ与CD107a反应；以多种靶向CD20、BCMA和GPRC5D的双特异性TCE，在PBMC单独体系及肿瘤细胞共培养体系中检测细胞毒性和IFNγ、IL-6、IL-1β释放；并选取每个物种4例代表性供体分离T细胞，在抗CD3刺激与未刺激条件下实施scRNA-seq，结合差异表达分析与TCR通路基因富集分析，比较物种间转录响应差异。

在结果部分，研究首先报告了“**T-cell phenotype and functional capacity were similar between species**”。通过流式细胞术，研究人员发现人和NHP供体的CD3⁺ T细胞总频率及CD4⁺/CD8⁺分布总体相近，NHP的CD3⁺ T细胞频率与CD4/CD8比值中位数略高。亚群层面，人供体CCR7⁺ T细胞比例更高，提示其中枢记忆T细胞库可能更丰富，而NHP在CD4⁺ T细胞内CD45RA⁺细胞比例更高。随后，研究人员采用PMA/离子霉素进行多克隆刺激，检测IFNγ胞内染色及CD107a脱颗粒标志。结果显示，两物种均出现浓度依赖性的强烈IFNγ和CD107a应答，说明其内在效应潜能均完整存在；且NHP在CD8⁺ T细胞中IFNγ和CD107a阳性比例甚至可高于人。这部分结果支持一个重要判断：NHP对TCE反应较弱，并非源于其T细胞普遍功能低下，而更可能与CD3依赖性特异激活环节相关。

第二部分结果为“**CD3 T-cell engagers stimulate species-specific functional responses**”。研究人员使用4种双特异性TCE，对人和NHP PBMC进行功能比较。首先在仅含PBMC的体系中，利用靶向CD20的TCE模拟NHP毒理研究中正常靶细胞参与的场景。结果显示，两物种PBMC对TCE-1均出现浓度依赖性的CD20⁺ B细胞耗竭，对TCE-2反应较弱，但人PBMC在TCE-1条件下表现出更强细胞毒性。更为突出的是，细胞因子方面人供体在TCE-1和TCE-2刺激下均产生显著更高水平的IFNγ，提示促炎通路激活程度更高。随后，研究人员将比较扩展至肿瘤共培养系统，分别采用表达CD20的Daudi细胞以及共表达BCMA/GPRC5D的MM.1S细胞。结果表明，CD20靶向TCE所得物种差异与PBMC单独体系一致；对于靶向BCMA和GPRC5D的TCE-3与TCE-4，两物种均显示明确浓度依赖性杀伤，但人PBMC在较低药物浓度下即表现出更高效力，且在TCE-4条件下最大细胞毒作用更强。值得注意的是，在全部4种TCE和全部肿瘤背景中，人供体产生的IFNγ始终高于NHP；补充结果还显示，在TCE-2和TCE-4刺激下，人供体IL-6与IL-1β水平也更高。这一部分明确说明：尽管NHP能够支持抗原依赖性细胞毒反应，但在人与NHP之间，TCE诱导的促炎细胞因子释放差异更加稳定且更为显著，这为NHP低估临床免疫毒性提供了直接功能学证据。

第三部分结果为“**Strength of T-cell receptor signaling differs between species**”。研究人员进一步借助单细胞转录组学，从机制层面比较CD3交联后TCR信号传导强度。采用包被抗CD3抗体刺激纯化T细胞后，先通过流式细胞术确认激活状态，观察到两物种均出现CD3下调与早期活化标志CD69上调，但人供体基线CD3平均荧光强度更高，刺激后CD69诱导也更明显。随后基于scRNA-seq分析Reactome数据库中的TCR通路基因，结果显示两物种在整体TCR信号架构上高度一致：一部分基因在刺激后变化不大；另一部分如CD3、CD4、LCK和ZAP70刺激后共同下调，符合TCR配体结合后的负反馈调控；还有一部分如蛋白酶体家族成员及NF-κB通路成分在两物种中均被显著上调，反映共同的下游激活程序。然而，仍存在一簇在人T细胞中特异性上调的基因，提示近端信号响应具有物种差异。差异表达分析进一步确认，人T细胞中LAT、PAG1、SKP1以及PI3K家族多个亚基基因如PIK3CA、PIK3CB和PIK3R2表达更高，同时泛素相关基因UBB和UBE2D2诱导更明显。这说明，尽管TCR信号网络总体保守，但人T细胞在CD3连接后的近端信号转导与调控装置激活更充分，可能因此具有更低的激活阈值或更强的信号放大能力，从而产生更强的药理反应。

讨论部分围绕这些结果建立了对TCE安全评估框架的重新认识。研究指出，人与食蟹猕猴在T细胞数量构成及多克隆刺激应答上的相似性，说明NHP并非不具备介导炎症和细胞毒效应的能力；但在TCE驱动的CD3特异性活化条件下，人源系统表现出更高的IFNγ释放及某些TCE条件下更强的细胞毒效力，这种跨多个已获批准TCE均可重现的差异，可解释NHP毒理研究为何常低估临床中以细胞因子为主导的免疫毒性。转录组结果进一步提示，NHP T细胞近端TCR信号分子表达较低，可能抬高了活化阈值，从而削弱其药理学敏感性。研究还强调，本研究主要考察CD3单独刺激或TCE介导的核心激活过程，尚未纳入共刺激、黏附分子结合、代谢重编程及抗原依赖性免疫突触动力学等更多体内因素，因此真实体内环境中的物种差异可能更为复杂。但基于现有证据，NHP研究仍可用于识别抗原依赖性细胞毒危害，尤其适用于正常组织表达分布或生理功能尚不清楚的新靶点TCE；对于以细胞因子释放为主要限速毒性的情境，则应更加依赖人源相关模型，如器官芯片（organ-on-chip）和组织特异性共培养体系，并将其与体内药代和药效数据整合，以提高活性剂量与毒性剂量预测的准确性。

研究结论部分可概括为：尽管NHP研究可为识别抗原依赖性细胞毒性风险提供有价值的信息，但其在预测TCE诱导的细胞因子介导毒性方面存在明显局限。人和NHP T细胞在整体TCR信号架构上虽具有保守性，但人T细胞具有更强的近端信号转录激活和更高的药理反应性。因而，TCE的非临床安全性评估应采用情境依赖的综合策略，在合理使用NHP研究的同时，纳入更多与人体相关的检测体系与新方法学，以更准确地反映物种特异性生物学和靶点特异性风险。