《Journal of Oral Microbiology》：Combined treatment with bacteriophages and sodium hypochlorite against E. faecalis biofilm in an in vitro root canal model with evaluation of bacterial resistance
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摘要：目的 评估新分离噬菌体对粪肠球菌(Enterococcus faecalis，E. faecalis)生物膜的时间依赖性抗菌活性，包括在两种体外(in vitro)模型中单独使用及与次氯酸钠(sodium hypochlorite，NaOCl)联用的效果
摘要：目的 评估新分离噬菌体对粪肠球菌(Enterococcus faecalis，E. faecalis)生物膜的时间依赖性抗菌活性，包括在两种体外(in vitro)模型中单独使用及与次氯酸钠(sodium hypochlorite，NaOCl)联用的效果，并评估潜在耐药性(resistance)的发生。方法 研究人员从污水中以E. faecalis ATCC 29212为宿主分离裂解性噬菌体CUB_EF02，经透射电子显微镜(transmission electron microscopy，TEM)观察形态并测序。首先在多孔玻璃珠上建立E. faecalis生物膜，进行时间—杀菌(time?killing)实验评估噬菌体抗菌效应。此外，在36颗离体单根人牙中建立10日龄E. faecalis生物膜，分别用0.9% NaCl(阴性对照)、1% NaOCl、噬菌体、噬菌体+NaOCl进行处理。于基线(T0)、处理后即刻(T1)及再孵育48 h(T2)采用平板计数法定量牙本质黏附生物膜菌落形成单位(colony?forming unit，CFU)，计算对数减少值(logarithmic reduction factor，LRFred.)，采用单因素方差分析(one?way ANOVA)及Tukey HSD检验进行统计分析。通过顶层琼脂覆皿斑点试验(top?agar overlay spot assay)评估噬菌体耐药性。结果 噬菌体处理6 h后生物膜减少1.35 ± 0.2 log，显著低于NaOCl单独处理(对数减少值LRFred.= 2.98 ± 0.77 SD)，但NaOCl与噬菌体联用抗菌效果最强(LRFred.= 4.05 ± 1.17 SD)。所有组均观察到细菌再生长(regrowth)，噬菌体孵育≥6 h后出现耐药性。结论 噬菌体是根管消毒中有前景的辅助手段，但其单独抗菌效能弱于NaOCl，且可能诱导细菌产生耐药性。
论文解读：噬菌体联合次氯酸钠处理对体外根管模型中粪肠球菌(Enterococcus faecalis)生物膜的清除作用及细菌耐药性评估
根管治疗后继发感染发生率可达15%，其中粪肠球菌(E. faecalis)在再治疗感染根管内检出率高达77%，其能侵入牙本质小管并形成生物膜(biofilm)，对常规化学机械预备所用冲洗液如乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)及次氯酸钠(sodium hypochlorite，NaOCl)具有一定耐受性，导致常规消毒难以彻底清除。现有标准疗法存在复杂根管系统(侧支根管、峡部等)清理盲区，过度扩大根管又易致根折。噬菌体(bacteriophage/phage)可特异性裂解宿主菌并携带胞外聚合物(extracellular polymeric substance，EPS)降解酶，有望破坏生物膜作为根管消毒辅助剂。本研究由研究人员开展，旨在评价新分离E. faecalis噬菌体CUB_EF02单独及联合1% NaOCl对体外根管模型中E. faecalis单菌种生物膜的杀灭效果及最佳作用时间，并检测噬菌体孵育后宿主菌耐药发生情况。研究结论表明噬菌体可作为根管消毒辅助剂但与NaOCl联用未达统计学显著差异，且单独使用可诱发细菌耐药。本文发表于《Journal of Oral Microbiology》。
主要关键技术方法：
研究人员收集36颗符合标准的离体单根人恒牙(伦理批号EA4/102/14，Charité—Universit?tsmedizin Berlin)，去冠、截根至19 mm、ProTaper Next系统预备至X4并17% EDTA去除玷污层，建立体外(in vitro)根管模型；自污水中以E. faecalis ATCC 29212为宿主采用双层琼脂法(double agar technique)分离纯化裂解性噬菌体CUB_EF02并经透射电镜(TEM)及Sanger测序鉴定；在多孔烧结玻璃珠上建立E. faecalis生物膜行时间—杀菌(time?killing)实验(0、2、4、6、24 h取样)；在离体牙根管内培养10 d形成牙本质黏附E. faecalis生物膜，随机分6组(n=6)：阴性对照(0.9% NaCl)、阳性对照(1% NaOCl)、CUB_EF02孵育6 h、CUB_EF02 6 h+1% NaOCl、CUB_EF02 24 h、CUB_EF02 24 h+1% NaOCl，分别于T0/T1/T2用ISO 25 Hedstroem锉刮取牙本质黏附菌经超声脱落、系列稀释涂布胰蛋白大豆琼脂(tryptic soy agar，TSA)平板计数菌落形成单位(colony?forming unit，CFU/mL)计算对数减少因子(logarithmic reduction factor，LRF)，用单因素方差分析及Tukey HSD事后检验比较；对T2回收菌落通过顶层琼脂覆皿斑点试验(top?agar overlay spot assay)检测噬菌体敏感性以评估耐药性。
研究结果
Plaque morphology and TEM visualisation（噬斑形态与透射电镜观察）
研究人员通过双层琼脂法获得具清晰裂解圈伴周围晕环(halo zone)的噬斑，TEM显示CUB_EF02属长尾噬菌体科(Siphoviridae/Bradley B型)，具六角形头部(直径约52.5 ± 5.02 nm)及长柔性非收缩尾(长197.8 ± 19.95 nm，宽8.7 ± 1.64 nm)，提示其为典型裂性噬菌体。
DNA sequencing using the sanger method（Sanger法DNA测序）
CUB_EF02基因组为双链DNA(dsDNA)，全长38,366 bp，与肠炎球菌噬菌体vB_EFaS_TV217(95.1%同源)及phiSHEF10(95.0%同源)最接近；注释出67个编码序列(coding sequences，CDS)，无溶原相关蛋白及毒力因子，含holin及内溶素(endolysin)裂解相关基因，预测为严格裂性生命周期，具治疗应用潜力。
Time?killing assay of EF02 biofilms on glass beads（玻璃珠上EF02生物膜时间—杀菌实验）
E. faecalis生物膜于多孔玻璃珠上经108PFU/mL CUB_EF02作用2、4、6、24 h均较对照组显著降菌(p＜0.05)，6 h达最大杀灭效果(1.35 ± 0.2 log CFU减少)，24 h与6 h相当，确定6 h为适宜作用时间。
In vitro biofilm establishment in root canals（根管内体外生物膜形成）
根管内接种E. faecalis过夜培养物，3 d达约105CFU/mL稳定牙本质黏附生物膜并维持至10 d，荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridisation，FISH)证实E. faecalis定植全根管壁，部分区域形成5–10 μm厚致密层，并可侵入管周牙本质深达80 μm。
Reduction of the dentine?adherent bacteria in the root canal model（根管内牙本质黏附细菌清除效果）
NaOCl单独处理对数减少值LRFred.= 2.98 ± 0.77 SD，显著高于噬菌体单独6 h(1.50 ± 0.23 SD，p＝0.021)或24 h( p＝0.005)；噬菌体6 h或24 h联用NaOCl LRFred.分别为4.05 ± 1.17 SD与相近数值，略优于NaOCl单用但未达统计学显著差异(p＞0.05)。单纯噬菌体组再生长量(LRFreg.)显著低于NaOCl组(p＝0.047)，但T2绝对活菌数与NaOCl组无差异(p＝1.00)。
Evaluation of bacterial resistance（细菌耐药性评估）
顶层琼脂覆皿斑点试验显示，亲本株及各6 h噬菌体单独处理回收菌落均出现清晰裂解区；而24 h噬菌体孵育组及24 h噬菌体+NaOCl联用组回收菌落无裂解区，表明噬菌体孵育≥24 h或联用NaOCl后再存活菌可对该噬菌体产生抗性。
讨论与结论总结
讨论指出NaOCl体积大、分子数多且本研究使用1%(临床常用3–5.25%)致二者直接效力难比；噬菌体先作用于生物膜EPS(本研究CUB_EF02噬斑周围见halo zone提示可能携带EPS解聚酶虽未明确注释基因)，削弱基质屏障促进NaOCl深层渗透是联用增效机制；单独噬菌体可致快速耐药(≥6 h即始现，24 h明确检出)，建议采用噬菌体鸡尾酒(cocktail)或重复给药防耐药；单菌种模型及实验室菌株为局限，未来需多菌种生物膜及临床分离株验证。研究结论：CUB_EF02噬菌体孵育可显著减少根管内E. faecalis单菌种牙本质黏附生物膜，但抗菌效果明显弱于1% NaOCl，且噬菌体孵育可诱导细菌产生噬菌体耐药性。噬菌体联合NaOCl较NaOCl单用清除效果略强但未达统计学显著，噬菌体是根管消毒中有前景的辅助手段，但是否能提升体内感染根管系统消毒效果尚待进一步研究。
