《Redox Report》：Rhaponticin alleviates pancreatic acinar cell necrosis by attenuating oxidative stress via modulation of the HIF-1α signaling pathway
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目的 本研究旨在探讨大黄苷（rhaponticin, Rha）对急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）中腺泡细胞损伤的保护作用及其机制。方法 研究采用多种体外和体内AP模型诱导胰腺腺泡细胞损伤，评估线粒体功能、坏死及氧化应激水平。通过网络药
目的 本研究旨在探讨大黄苷（rhaponticin, Rha）对急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）中腺泡细胞损伤的保护作用及其机制。方法 研究采用多种体外和体内AP模型诱导胰腺腺泡细胞损伤，评估线粒体功能、坏死及氧化应激水平。通过网络药理学和分子对接预测潜在分子靶点，并进行实验验证；进一步探讨缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha, HIF-1α）信号通路及坏死性凋亡（necroptosis）相关蛋白——受体相互作用蛋白激酶3（receptor-interacting protein kinase 3, RIP3）和磷酸化混合谱系激酶结构域样蛋白（phosphorylated mixed lineage kinase domain-like protein, p-MLKL）的参与情况。采用药理学抑制和siRNA介导的敲低方法验证Rha的靶点特异性。结果 Rha处理显著保护线粒体功能、降低活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平并减轻胰腺损伤 motifs: 网络药理学和分子对接结果鉴定HIF-1α为Rha的关键靶点。一致地，Rha处理显著下调HIF-1α表达，并通过抑制RIP3和p-MLKL的激活来抑制坏死性凋亡。值得注意的是，在Rha存在的情况下，无论是药理学抑制还是siRNA介导的HIF-1α敲低均未产生额外的保护作用，表明HIF-1α参与了介导Rha的作用。结论 Rha通过HIF-1α介导的坏死性凋亡通路有效减轻腺泡细胞坏死和氧化应激，凸显其作为AP治疗候选药物的潜力。
急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是一种临床常见的胰腺炎症性疾病，致病因素多样，主要包括胆石症、慢性酒精滥用、高脂血症、药物作用及感染等病原体因素。病理上，该病起始于是胰腺内胰蛋白酶原过早激活，导致胰酶对胰腺组织的自身消化，继而出现水肿、出血和坏死等病理改变，并进一步触发局部及全身性炎症级联反应。AP的临床进展可能十分迅速，重症AP对生存构成重大威胁，死亡率高达15%～30%。研究表明，胰腺腺泡细胞损伤或死亡是AP发病机制中的关键始动事件，腺泡细胞损伤程度与疾病严重程度和临床预后密切相关。临床前研究表明，在初始阶段抑制胰腺腺泡细胞死亡可改善临床结局，支持该过程在AP进展中的关键作用。因此，以保护腺泡细胞为核心的治疗策略被认为对阻断AP发展至关重要，已成为AP病理机制研究和靶向药物发现的主要焦点。
胰腺腺泡细胞是胰腺外分泌功能的基本功能单位，其特定形式的死亡及随后的炎症损伤是决定AP进展和患者预后的关键因素。若未及时得到有效治疗，这些病理过程可能升级为广泛性胰腺破坏和全身炎症反应综合征等严重并发症。腺泡细胞死亡可通过多种途径表现，包括NLRP3炎症小体介导的焦亡（pyroptosis）、铁依赖性脂质过氧化物积累驱动的铁死亡（ferroptosis），以及坏死性凋亡——一种近期在炎症和免疫相关研究中受到重视的机制。鉴于这些复杂机制，本研究旨在识别并验证能够有效抑制腺泡细胞死亡并促进AP细胞修复的治疗策略。
大黄苷（rhaponticin, Rha）是一种源于大黄根茎的天然二苯乙烯苷类化合物，具有抗炎、抗菌、清除自由基和抗肿瘤等多种活性。越来越多的证据表明，Rha可通过抑制炎症通路显著减轻结肠炎、关节炎及人内皮细胞炎症等多种病理条件下的组织损伤，凸显其潜在的治疗多样性。这些发现提示Rha可能具有多效性和多靶点机制，尤其在炎症相关组织损伤中。然而，目前缺乏对Rha治疗AP潜力的全面评估，其保护作用的分子基础尚不清楚。
本研究通过AP模型综合评估Rha的治疗效果，并进一步整合网络药理学、分子对接以及体内外实验探讨其潜在机制，为AP的临床治疗提供科学依据。
本研究采用的技术方法主要包括以下关键内容：体外实验采用胆囊收缩素（cholecystokinin, CCK）刺激原代小鼠胰腺腺泡细胞及人胰腺腺泡细胞（human pancreatic acinar cells, hPACs）建立细胞损伤模型，采用牛磺胆酸钠（sodium taurocholate, NaT）和牛磺石胆酸3-硫酸酯（taurolithocholic acid 3-sulfate, TLCS）诱导细胞损伤；体内实验采用雨蛙肽（caerulein, Cae）诱导的AP模型、乙醇联合棕榈油酸（palmitoleic acid, POA）诱导的酒精性AP模型，以及NaT逆行胆胰管灌注诱导的AP模型。研究利用网络药理学方法从GeneCards、DisGeNET、OMIM、SymMap、Swiss Target Prediction、SuperPred和TargetNet等数据库筛选靶点，通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，并使用AutoDock Vina进行分子对接。实验验证技术包括：CCK-8法及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放实验检测细胞毒性；钙黄绿素-AM/碘化丙啶（Calcein-AM/PI）双染评估细胞死活；JC-1探针检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP）；MitoSOX探针检测线粒体ROS；二氢乙啶（dihydroethidium, DHE）检测细胞内ROS；腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate, ATP）及NAD
+/NADH试剂盒检测能量代谢；Western blot检测HIF-1α、RIP3、MLKL、p-MLKL及氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）复合物蛋白表达；免疫组织化学和免疫荧光染色检测组织病理及蛋白定位；ELISA检测血清炎症因子；以及siRNA介导的HIF-1α基因沉默和HIF-1α抑制剂PX-478的药理学干预。
**3.1 Rha对胰腺腺泡细胞体外活力及线粒体损伤的影响**
为建立体外损伤细胞模型，研究人员采用CCK刺激小鼠原代腺泡细胞。与对照组相比，CCK模型组LDH释放显著升高，而不同剂量的Rha可剂量依赖性地抑制CCK诱导的LDH释放，其中5 μM浓度表现出最显著的细胞保护效果，故被选为后续实验的最佳剂量。Calcein-AM/PI染色进一步证实5 μM Rha可有效维持腺泡细胞活力并改善CCK诱导的细胞损伤。腺泡细胞损伤常伴随明显的氧化应激，线粒体功能障碍被认为是导致细胞损伤的中心环节。研究人员采用JC-1红/绿荧光比值和MitoSOX分别检测线粒体膜电位和线粒体ROS产生。结果显示，CCK暴露显著增加线粒体ROS水平并降低JC-1聚集，而Rha处理明显逆转这些变化。Rha还恢复了NAD
+/NADH比值和细胞内ATP水平。此外，Western blot分析表明Rha挽救了CCK诱导的关键OXPHOS复合物蛋白（Complex I-V）的抑制。这些发现证明Rha可在体外条件下显著缓解CCK诱导的腺泡细胞损伤。
**3.2 Rha减轻AP中的胰腺损伤**
研究人员采用Cae诱导的AP模型进一步评估Rha的治疗潜力。与对照组相比，Cae处理小鼠的胰腺样本显示明显水肿、炎症浸润和局灶性腺泡坏死。Rha治疗可显著改善这些病理改变，其中中等剂量（200 mg/kg）展现出最强的保护效果，优于高剂量（400 mg/kg）和低剂量（100 mg/kg）方案。此外，Cae处理小鼠血清淀粉酶和脂肪酶浓度较对照动物显著升高，而Rha给药显著降低这些酶学指标，200 mg/kg剂量表现出最显著的 normalizing 效应。基于这些综合结果，中等剂量Rha被确定为最佳剂量并用于后续机制研究。抗淀粉酶抗体的免疫荧光染色进一步确认了Rha的保护作用：Cae组胰腺组织中淀粉酶表达较NC组明显降低，而Rha干预后该降低被有效逆转。为评估Rha在不同病因诱导AP中的治疗普适性，研究人员进一步检测了其在酒精性AP模型和NaT-AP模型中的保护作用。组织病理学分析显示两种模型均表现出腺泡细胞坏死、炎症细胞浸润和间质水肿等典型胰腺损伤特征，而Rha治疗显著缓解这些病理改变。血清生化检测也表明Rha显著降低血清淀粉酶和脂肪酶水平。这些一致的发现提示Rha可能在不同病因的AP中均发挥有益作用，具有作为治疗候选药物的潜力。
**3.3 Rha抑制胰腺组织炎症细胞浸润**
为评估胰腺炎症细胞浸润，研究人员测定了血清关键促炎细胞因子水平。Rha给药显著降低IL-1β、IL-6和TNF-α水平，200 mg/kg剂量效果最为显著。这种全身性炎症的抑制与胰腺腺泡细胞损伤的改善密切相关。F4/80和MPO免疫染色显示，与Cae组相比，Rha显著减少胰腺巨噬细胞和中性粒细胞浸润。因此，Rha通过有效抑制炎症细胞募集和细胞因子产生缓解Cae诱导的AP。
**3.4 网络药理学分析揭示HIF-1α是Rha缓解AP的关键靶点之一**
靶点筛选鉴定出674个Rha相关靶点、10,283个AP相关靶点和2,185个细胞死亡相关靶点。交集分析显示这些数据集之间存在222个重叠核心靶点。后续KEGG通路评估显示，在这些重叠靶点中HIF-1α信号轴按统计显著性排名显著富集。基于STRING数据库构建的PPI网络包含217个节点和4,238个相互作用，平均每个节点39.1个连接。网络拓扑分析鉴定HIF-1α为网络结构中的中心枢纽。分子对接显示Rha与HIF-1α的结合能为-7.7 kcal/mol，属于强结合。这些结果提示Rha可能通过直接结合HIF-1α而作为HIF-1α信号通路的拮抗剂发挥作用。
**3.5 Rha抑制AP中HIF-1α介导的坏死性凋亡和氧化应激**
为检测Rha对AP期间HIF-1α的影响，研究人员通过Western blot分析胰腺组织中HIF-1α蛋白水平。结果显示，Cae诱导的AP模型中HIF-1α和坏死性凋亡标志物（RIP3和p-MLKL）显著上调，而Rha处理显著抑制这些变化。免疫组织化学染色进一步证实Cae组胰腺组织中HIF-1α和p-MLKL表达增强，Rha干预后这些增加被显著减弱。此外，模型组4-HNE表达显著增加而GPX4表达明显降低，Rha处理有效逆转这些改变，证明其强抗氧化应激活性。这些结果表明Rha可通过抑制HIF-1α信号通路缓解AP小鼠的炎症发病机制。
**3.6 HIF-1α抑制剂PX-478消除了Rha对AP的保护作用**
基于Rha的细胞保护特征，研究人员采用HIF-1α抑制剂PX-478进行挽救实验以阐明其分子机制。通过LDH释放实验进行剂量筛选，1.25 μM PX-478表现出最显著的保护效果，被选为后续细胞机制实验的最佳浓度。后续通过LDH定量及Calcein-AM/PI双染进行的挽救评估显示，Rha未能在PX-478单药治疗基础上提供额外的治疗获益。此外，研究人员成功在266-6细胞中通过siRNA建立HIF-1α敲低模型。与先前发现一致，沉默HIF-1α可缓解腺泡细胞损伤。值得注意的是，在HIF-1α敲低细胞中Rha处理未产生额外保护效果。这些发现提示Rha可通过调控HIF-1α信号轴改善AP，有效减轻胰腺腺泡细胞损伤。
研究人员进一步研究了PX-478对Rha体内保护作用的影响。参照Shen等的报道，100 mg/kg PX-478给药可提供显著保护作用，有效减少AP模型中的腺泡细胞坏死，本研究采用该剂量作为循证方案。与先前体内发现一致，Cae组胰腺组织较NC组表现出明显水肿、炎症细胞浸润和腺泡细胞坏死。值得注意的是，Rha与PX-478联合给药未产生额外治疗效果，胰腺组织损伤程度和血清淀粉酶/脂肪酶浓度与PX-478单药治疗相当。这些结果进一步验证了HIF-1α介导Rha的药理效应。此外，Rha显著减轻TLCS诱导的人腺泡细胞损伤，表现为LDH释放减少和ROS积累降低，这与小鼠胰腺腺泡细胞中的观察结果高度一致。Rha的保护作用与PX-478相当，两者联合未产生额外保护效果，提示Rha在人细胞环境中主要通过HIF-1α通路发挥治疗作用。
讨论部分指出，AP是临床常见疾病，以严重上腹痛、恶心和呕吐为特征。近年来，AP的发病率和死亡率均呈上升趋势。当前临床管理主要依赖液体复苏、抗生素、镇痛和内镜逆行胰胆管造影等支持策略，但这些传统方法的疗效有限，缺乏针对腺泡细胞损伤的靶向干预。作为胰腺外分泌的主要功能单位，腺泡细胞在AP期间特别容易受到氧化和炎症损伤。早期腺泡细胞死亡导致的胰腺坏死是疾病严重程度和患者死亡率的关键决定因素，且腺泡损伤程度与AP的临床严重程度和预后结局直接相关。因此，保护腺泡细胞并恢复氧化还原平衡的干预措施对改善AP结局至关重要。
本研究中，Rha被证明在三种经典小鼠AP模型中显著减轻腺泡细胞损伤、减弱炎症反应和缓解氧化应激。值得注意的是，Rha在人胰腺腺泡细胞中也表现出明显的保护作用。Rha减少线粒体ROS产生并维持线粒体膜电位，从而改善细胞能量代谢和活力。这些发现首次揭示了Rha对AP的保护作用，支持其作为新型抗氧化剂和抗炎剂的潜力。网络药理学分析鉴定HIF-1α为Rha缓解AP的关键靶点。HIF-1α是一种氧化还原敏感的转录因子，协调细胞对缺氧和炎症的适应。在AP微环境中，组织缺血和水肿触发HIF-1α激活，导致线粒体功能障碍、坏死性凋亡和ROS积累。与先前报道一致，本研究的体内外数据显示Rha抑制HIF-1α表达，下调RIP3和p-MLKL，减轻氧化损伤，从而保护腺泡细胞功能和组织完整性。
研究结论：Rha通过抑制HIF-1α信号通路减少氧化应激和腺泡细胞坏死，从而改善AP。作为一种化学结构明确的植物单体，Rha具有良好的生物安全性和生物利用度，展现出明确的机制优势和转化潜力。这些发现凸显Rha作为AP治疗的有前景的氧化还原调节候选药物。
