卵清蛋白(ovalbumin, OVA)氧化修饰指纹图谱取决于气体等离子体驱动的活性物种(reactive species)谱

《Redox Report》：Ovalbumin oxidative modification fingerprints depend on gas plasma-driven reactive species profiles

　　

摘要：氧化蛋白质修饰与多种疾病相关，但其修饰的种类和多样性尚缺乏深入研究。研究人员以鸡卵清蛋白(ovalbumin, OVA)为模型蛋白，利用可作为多种活性物种 potent来源的气体等离子体(gas plasma)技术诱导蛋白质氧化。借助高分辨质谱(high-resolution mass spectrometry)及自建分析流程，在氨基酸分辨率水平绘制了80余种不同的氧化蛋白质修饰(oxidative protein modifications, oxMods)。为探究修饰谱如何随活性物种种类和浓度变化，研究人员通过系统改变分子气体添加物（水、乙醇、氧气和氮气）构建了12种不同组成的氩气(Argon, Ar)气体等离子体。采用光学发射光谱(optical emission spectroscopy, OES)及沉积长寿命物种（过氧化氢H2O2、亚硝酸根NO2?和硝酸根NO3?）的光度法定量对气体等离子体条件进行表征，揭示添加物对活性氧/活性氮(reactive oxygen/nitrogen species, ROS/RNS)指纹图谱的影响。将与质谱数据的关联分析显示，原子氧(atomic oxygen, O)和液相沉积的H2O2在蛋白质氧化中起显著作用。特定进料气组成所富集的特定ROS/RNS产生了可解析至氨基酸水平的特异性OVA氧化谱。研究发现存在进料气依赖的氧化热点(oxidation hotspots)，如干燥氩气模式下Trp149为热点，富含羟基自由基(·OH)的加湿氩气模式下Met274为热点。该项首创性研究以OVA为模型体系，揭示了动态活性物种环境与蛋白质氧化谱之间的复杂关系。

论文解读：卵清蛋白氧化修饰指纹图谱取决于气体等离子体驱动的活性物种谱

本研究发表于《Redox Report》。蛋白质氧化修饰(oxidative protein modifications, oxMods)与氧化应激相关的多种病理过程密切相关，然而生理或病理条件下往往涉及多种极短寿命的活性氧/活性氮(reactive oxygen and nitrogen species, ROS/RNS，如·OH半衰期约10^?9s、单线态氧¹O₂半衰期约10^?5s)，难以通过传统化学方法可靠模拟复杂的ROS/RNS环境。气体等离子体(gas plasma)技术在常压下可产生多种ROS/RNS且可通过进料气(feed gas)组成调控活性物种谱，是潜在的氧化还原研究工具，但目前尚未建立等离子体特征与蛋白质特定修饰模式之间的对应关系。为此，研究人员以卵清蛋白(ovalbumin, OVA，UniProt ID: P01012)为模型蛋白，系统构建12种不同氩气基进料气组成（干燥氩气Ar_dry、1%乙醇饱和氩气Ar_EtOH、1%水饱和氩气Ar_H2O，各模式分别添加无添加物θ、0.5% N₂、0.5% O₂、0.25% N₂+0.25% O₂）产生的气体等离子体处理OVA溶液，联合气相光学发射光谱(optical emission spectroscopy, OES)、液相长寿命ROS/RNS定量（H₂O₂用Amplex Ultra Red法、NO₂^?和NO₃^?用Griess法）、高分辨液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS，Thermo Fisher Exploris 480，数据依赖采集DDA模式，Proteome Discoverer + Byonic搜索引擎鉴定氨基酸分辨率氧化修饰)，经Spearman相关性分析及主成分分析(principal component analysis, PCA)解析等离子体ROS/RNS谱与OVA位点特异性氧化修饰的关联。研究旨在验证气体等离子体可通过调控进料气组成产生可预测的蛋白质氧化指纹图谱，为氧化还原生物学研究提供可控氧化模型。

主要关键技术方法

研究人员以鸡卵清蛋白(OVA, P01012)为模型蛋白，用kINPen大气压冷等离子体射流在导电模式(conductive mode，射流接触液面)下以12种不同组分的氩基进料气（Ar_dry、Ar_H2O、Ar_EtOH，各含四种分子添加条件）处理OVA的DPBS溶液20 s；采用光学发射光谱(OES)归一化表征等离子体气相激发态物种；用荧光/比色法测定处理后液相中沉积的长寿命物种H₂O₂、NO₂^?、NO₃^?；等离子处理后样品经还原(二硫苏糖醇DTT)、烷基化(碘乙酰胺IAA)及胰蛋白酶(trypsin)酶解，经STAGE-Tip脱盐后进行纳升LC-MS/MS(DDA模式)检测；质谱数据用Proteome Discoverer联用Byonic搜索引擎匹配自建氧化修饰数据库鉴定氨基酸分辨率oxMods，以肽谱匹配(peptide-spectrum match, PSM)计数半定量，经严格过滤(Byonic score ≥250、logProb ≥3、delta mod score ≥10、1% FDR)，最终将气相OES信号、液相ROS定量数据与氨基酸水平氧化修饰谱进行Spearman相关分析及PCA。

Feed gas modified ROS/RNS fingerprints in plasma gas phases

研究人员通过OES表征各放电条件下等离子体气相发射谱，发现所有条件均存在特征氩线；Ar_H2O和Ar_EtOH中观测到N₂第二正带系(second positive system, SPS，337 nm和357 nm)及OH(A-X)发射线(309 nm)，添加N₂提升N₂(SPS)强度，添加O₂显著提升原子氧线O(777 nm和844 nm)，乙醇添加淬灭原子氧发射；层次聚类及PCA显示干燥模式各添加物导致气相谱差异最大并沿PC2明显分离，加湿模式中不同分子添加物引起的气相谱变化相对较小。结论：进料气分子添加物显著改变等离子体气相激发态物种组成，干燥模式调控效应最强。

Feed gas humidification boosted hydrogen peroxide deposition into liquids

研究人员测定等离子体处理DPBS后液相沉积的长寿命物种浓度，显示Ar_H2O使H₂O₂沉积较Ar_dry（~60 μM）升高约4倍（~240 μM），Ar_EtOH添加N₂+O₂时H₂O₂可达~750 μM；NO₂^?沉积在添加N₂时显著升高（Ar_H2O+N₂约为Ar_dry+N₂的4倍），添加O₂则抑制NO₂^?生成；NO₃^?在Ar_EtOH模式下几乎无积累。PCA显示EtOH条件（θ、O₂、N₂+O₂）与高H₂O₂负荷关联，含O₂添加及O₂+N₂条件与OES原子氧线关联，加湿模式中添加N₂与弱OH线及高NO₂^?关联。结论：进料气加湿尤其是乙醇饱和显著提升液相H₂O₂沉积，分子添加物调控RNS（NO₂^?/NO₃^?）生成。

Molecular gas additives altered gas plasma-mediated protein oxidation

研究人员在OVA中共鉴定82种不同oxMods，所有条件共有62种为核心修饰；Ar_dry模式oxMods种类及PSM计数最高（单个修饰可达~150 PSM），加湿模式显著降低（最高~60 PSM）；Ar_dry中加分子添加物多数oxMods减少（除少数特殊修饰外），Ar_EtOH中添加N₂或N₂+O₂增加修饰数，Ar_H2O中添加O₂或N₂减少修饰数；Ar_dry特有8种氧化类型（如+2O、+3O、?2H、?1H+1Cl、?1H+1NO₂硝基化等），Ar_EtOH特有2种（含乙酰化?1H+2C+3H+1O），Ar_H2O特有1种；Venn图显示三模式共享修饰0种，两两组间共享5～6种。PCA显示Ar_H2Oθ和+N₂沿PC2轴与其他条件分离。结论：分子气体添加改变等离子体介导的蛋白质氧化修饰谱的类型、多样性及丰度，主要进料气模式（干/湿）影响大于次要分子添加物。

Correlation analysis on gas plasma-derived reactive species and protein oxidation

研究人员将氨基酸水平oxMods与OES激发线及液相H₂O₂沉积做Spearman相关（|r|≥0.6，p<0.05），发现OES原子氧线O(777 nm)与若干残基氧化呈显著相关，N₂(SPS)线相关较弱，OH(309 nm)线多为负相关但不显著，NO线及NO₂^?无显著相关；H₂O₂沉积与多种残基氧化呈正负相关。热图显示H₂O₂与O(777 nm)所关联的氧化事件不重叠——H₂O₂主要正关联极性氨基酸（Asp/Asn、Glu/Gln、Lys）的氧化脱酰胺及乙酰化，O(777 nm)主要关联芳香族氨基酸（Trp、His）氧化且呈相反趋势。氨基酸分辨率氧化热点热图显示Ar_dry氧化最强，热点为含硫(Cys74、Met197、Met274、Cys368)及芳香族(F66、W149、W268、H332、H371)残基，其中Trp149为Ar_dry特征热点；加湿模式氧化残基较少，Met274为Ar_H2O富含·OH条件下的特征热点；Met氧化与Ar_EtOH高H₂O₂条件强关联。全局PCA将所有实验数据整合，干燥氩气条件与其余11种明显分离，同大模式（干/水湿/乙醇湿）各自聚簇，分子添加微调位置。结论：液相H₂O₂和气相原子氧是驱动不同特征oxMods的关键ROS，H₂O₂偏好氧化Met及极性残基（脱酰胺、乙酰化），短寿命ROS（原子氧、¹O₂、·OH等）主导芳香族残基氧化；进料气主体模式（干vs湿）决定氧化谱大框架，分子添加进行精细调节。

讨论与结论总结

讨论指出OES仅能探测发光激发态，长寿命液相物种（H₂O₂、NO₂^?）为短寿命气相物种的替代指标；Ar_dry产生最丰富的短寿命ROS故oxMods最多最多样，原子氧可通过液相生成次氯酸参与芳香环氯化及氧化，Trp→N-甲酰犬尿氨酸提示存在¹O₂；EtOH加湿因烷基自由基清除O和·OH致原子氧OES线消失，但促进H₂O₂及过氧乙酸形成，特异引入乙酰化并与Met氧化强关联，可模拟炎症相关Met亚砜积累；加湿模式总体oxMods少因除H₂O₂外ROS密度低，H₂O₂单独氧化能力有限；RNS诱导修饰极少，气相N₂(SPS)不直接转化为液相蛋白硝化。kINPen多ROS输出优于单一氧化剂可更好模拟病理复合氧化应激，并可定向调控产生特定氧化指纹用于功能研究或新抗原开发。

结论(Conclusio部分原文意译)：据研究人员所知，本研究首次系统关联12种气体等离子体放电模式生成的ROS/RNS谱与蛋白质氧化模式。通过整合OES、液相活性物种定量及氨基酸分辨率氧化分析，明确了可指导选择进料气组成以诱导定向蛋白质氧化的清晰趋势，该框架可为未来利用气体等离子体技术制备氧化蛋白以进行氧化修饰功能分析的研究提供参考。