水貂源多重耐药(multidrug-resistant, MDR)大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)中携带mcr-1.1与blaCTX-M?55基因可转移质粒(plasmid)的出现

《Transboundary and Emerging Diseases》：Emergence of Transferable Plasmid Coharboring mcr-1.1 and blaCTX-M?55 Genes in Multidrug-Resistant Escherichia coli From Mink

　　

多重耐药(MDR)细菌降低了抗菌药物的疗效，并限制了人和动物临床中可用的治疗方案。动物源性大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)中的抗菌药物耐药性(antimicrobial resistance, AMR)愈发普遍，许多分离株对多种类别的抗菌药物表现出耐药性。然而，与其他动物来源相比，水貂源大肠杆菌的耐药特征，特别是其基因组特征，尚不清楚。本研究研究人员从中国患出血性肺炎(hemorrhagic pneumonia, HP)死亡养殖水貂的肺组织中鉴定出一株MDR大肠杆菌菌株EC0D1。药敏试验表明，EC0D1对β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类和多黏菌素(polymyxins)耐药，但对碳青霉烯类(carbapenems)和替加环素(tigecycline)敏感。全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)显示EC0D1含有一条染色体和八条质粒(plasmid)。其中，质粒pEC0D1-3共携带blaCTX-M?55和mcr-1.1基因，而pEC0D1-2携带tet(A)和floR基因，共同解释了观察到的MDR表型。系统发育分析将EC0D1归类为序列型ST457(sequence type ST457)，并显示其与数株人源临床分离株亲缘关系密切。比较基因组分析进一步揭示，质粒pEC0D1-2和pEC0D1-3与先前在禽源大肠杆菌及人源肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)分离株中发现的质粒具有高度序列相似性。接合(conjugation)试验证实，携带blaCTX-M?55、mcr-1.1、tet(A)和floR基因的质粒可转移至不同细菌受体菌。水貂相关大肠杆菌中出现可转移的耐药决定因子，提示其在人与动物宿主间耐药性基因传播中可能发挥作用。

本研究发表于《Transboundary and Emerging Diseases》。目前，动物源性大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)中的抗菌药物耐药性(antimicrobial resistance, AMR)日益严重，但相较于猪、禽、牛等常见畜禽，水貂源大肠杆菌的耐药特征及其基因组背景研究较少，尤其缺乏对其携带重要临床耐药基因（如产超广谱β-内酰胺酶extended-spectrum β-lactamases, ESBLs基因bla_CTX-M?55及质粒介导的多黏菌素(colistin/polymyxin)耐药基因mcr-1）及可移动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs)特征的了解。水貂作为经济毛皮动物及潜在野生动物宿主，可能参与全球AMR传播网络。为明确水貂源致病性大肠杆菌是否携带并可传播关键临床耐药基因，研究人员从患出血性肺炎(hemorrhagic pneumonia, HP)死亡水貂肺组织中分离菌株，综合运用药敏试验、PCR、全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)杂交组装、生物信息学注释与比较基因组分析、接合(conjugation)转移试验等手段，鉴定出一株属于ST457序列型的多重耐药(multidrug-resistant, MDR)大肠杆菌EC0D1。该菌株的一条IncI2型质粒pEC0D1-3同时携带bla_CTX-M?55与mcr-1.1，另一条IncX1/IncB/O/K/Z型质粒pEC0D1-2携带tet(A)与floR，且两条质粒均可接合转移至大肠杆菌J53及肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae) 293Z受体菌。系统发育分析显示该水貂源菌株与多人源临床ST457菌株遗传关系密切，其耐药质粒与已报道的禽源、人源肠杆菌科质粒高度同源。研究表明水貂可成为bla_CTX-M?55与mcr-1.1等关键耐药基因的动物储存库，并通过可转移质粒参与跨宿主AMR传播，对公共卫生具有重要意义。

研究人员选取中国北方某水貂场死于出血性肺炎(HP)的水貂肺组织进行细菌分离获得 extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) 候选株EC0D1；采用Kirby–Bauer纸片扩散法结合CLSI与EUCAST判读标准进行抗菌药物敏感性测定，并以肉汤微量稀释法测最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)；用基因特异性引物PCR检测mcr-1.1与bla_CTX-M?55等耐药基因(antimicrobial resistance genes, ARGs)；提取基因组DNA后联合Illumina NovaSeq短读长与Oxford Nanopore长读长数据进行混合组装(hybrid assembly, CANU/HGAP + Pilon校正)获完整染色体及质粒序列；利用RAST、ABRicate调用ResFinder/VFDB/PlasmidFinder进行注释与质粒不相容群(incompatibility group, Inc group)分型；使用BRIG与Easyfig进行质粒比较基因组共线性与结构可视化；基于EnteroBase进行核心基因组多位点序列分型(core genome multilocus sequence typing, cgMLST)及单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)系统发育树构建；以E. coli J53(NaN₃抗性)与K. pneumoniae 293Z(K₂TeO₃抗性)为受体菌进行滤膜接合试验，含相应抗生素与选择性标记平板筛选转接合子(transconjugants)并经PCR确认质粒携带基因及计算转移频率。

3.1. An E. coli Strain EC0D1 Exhibits MDR Phenotype

研究人员对EC0D1进行药敏测定与PCR检测，发现其对头孢他啶(ceftazidime, MIC >64 μg/mL)、头孢呋辛(cefuroxime, >64 μg/mL)、头孢噻肟(cefotaxime, >256 μg/mL)、多黏菌素B(polymyxin B, 4 mg/L)、四环素(tetracycline, 16 μg/mL)、氯霉素(chloramphenicol, >64 μg/mL)、链霉素(streptomycin, >64 μg/mL)及恩诺沙星(enrofloxacin, >32 μg/mL)高水平耐药，对亚胺培南(imipenem, <0.125 μg/mL)与替加环素(0.032 μg/mL)敏感；PCR证实菌株携带mcr-1.1与bla_CTX-M?55。结论：EC0D1呈现典型MDR表型，且耐药谱与检出的ARGs相符。

3.2. Genomic Features and Phylogenetic Analysis of the ST457 Isolate EC0D1

研究人员完成EC0D1全基因组组装，获得一条4,981,095 bp染色体(GC 50.46%)及8条质粒(pEC0D1-1至pEC0D1-8，大小3066~193,068 bp)。染色体携带bla_OXA?1、aac(3)-IV、aph(6')-Ib-cr、ant(3")-IIa、aph(4)-Ia、sul1、sul3；pEC0D1-3(IncI2, 66,034 bp)共携带bla_CTX-M?55与mcr-1.1；pEC0D1-2(IncB/O/K/Z + IncX1, 137,957 bp)携带floR、tet(A)、sul2、ant(3")-IIa。cgMLST与SNP系统发育分析显示EC0D1为ST457型，与人源临床分离株聚为一支，亲缘关系紧密，且ST457在全球人、禽、畜及环境中均有分布并常携带bla_CTX-M与mcr-1。结论：水貂源EC0D1与重要的人源MDR ST457克隆密切相关，具备跨宿主传播潜力。

3.3. Plasmid pEC0D1-2 Carries Multiple Resistance Genes Within a Conserved Multidrug Resistance Region

研究人员对pEC0D1-2进行比较基因组分析，发现其与已发表的肺炎克雷伯菌质粒pKPWX136(CP069173.1)、大肠杆菌质粒pJnd12(CP095822.1)等禽/人源肠杆菌科质粒序列相似度>95%，多耐药区(MDR region)含tet(A)、floR、sul1、aadA2、aph(3")-Ib、aph(6)-Id，侧翼有IS26、IS91、Tn3、Tn5等MGEs，并含完整IV型分泌系统(type IV secretion system, T4SS)、偶联蛋白(T4CP)、松弛酶(relaxase)及转移起点(oriT)。结论：pEC0D1-2具有保守MDR骨架及接合转移功能模块，与已知跨宿主传播质粒高度同源，具备基因捕获与水平转移能力。

3.4. Characterization of Plasmid pEC0D1-3 Coharboring bla_CTX-M?55and mcr-1.1 Genes

研究人员分析pEC0D1-3(IncI2, 66,034 bp, GC 42.54%)结构，其与已发表大肠杆菌质粒pEC12_3(CP095833.1)、人源产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)质粒pCRENT-301(KY657477.1)等相似度>95%；mcr-1.1两侧为ISApl1与IS26，bla_CTX-M?55附近亦有IS元件，MDR骨架在参比质粒中保守，含T4SS相关基因。结论：IncI2型pEC0D1-3为典型mcr-1.1传播载体，且罕见地共定位bla_CTX-M?55，具备接合转移潜能，可能与临床人/禽源质粒有共同起源或发生过种间交换。

3.5. Multidrug-Resistance Plasmids pEC0D1-2 and pEC0D1-3 Are Transferable Into Multiple Bacterial Recipients

研究人员进行接合试验，pEC0D1-2成功转移至E. coli J53(选四环素或氯霉素+NaN₃平板)，转接合子PCR证实含tet(A)与floR；pEC0D1-3成功转移至E. coli J53与K. pneumoniae 293Z(选colistin或cefotaxime+选择剂)，转接合子PCR证实含mcr-1.1与bla_CTX-M?55；pEC0D1-3向J53与293Z的转移频率分别为10^?2与10^?3/recipient。结论：两条关键耐药质粒均具接合转移性，可在不同菌种(大肠杆菌与肺炎克雷伯菌)间稳定传递并表达耐药表型。

讨论与结论总结

讨论指出水貂可通过频繁接触人、家畜及环境微生物参与AMR传播网络，养殖场抗菌药物使用构成选择压。EC0D1较既往报道水貂源大肠杆菌携带更具临床重要性的bla_CTX-M?55与mcr-1.1，扩展了这些关键耐药基因已知的生态分布。ST457是全球化MDR E. coli 谱系，水貂源EC0D1与多人源临床株密切聚类说明ST457可能促进耐药基因跨生态位循环。接合试验证实pEC0D1-2与pEC0D1-3具广宿主转移能力，尤其可转入院内重要病原菌K. pneumoniae，增加临床与环境AMR扩散风险。pEC0D1-2含IS26/Tn3利于基因重排与捕获，pEC0D1-3为IncI2型mcr-1.1经典载体且共载bla_CTX-M?55，与临床K. pneumoniae质粒高度同源暗示种间交换。综上，水貂相关E. coli可作为耐药基因源，发现可转移共携带mcr-1.1与bla_CTX-M?55的质粒提示跨菌种持久与传播风险上升，需持续监测。

Conclusion(结论部分翻译)

研究人员通过全基因组测序从养殖水貂中鉴定出一株MDR E. coli 菌株EC0D1，其可接合质粒pEC0D1-3共携带bla_CTX-M?55与mcr-1.1，质粒pEC0D1-2携带tet(A)与floR。接合试验证实这些耐药基因可水平转移，介导对多黏菌素、第三代头孢菌素及四环素的耐药性。结果表明这些质粒具高转移潜能并可在不同细菌宿主中稳定维持，提示水貂源E. coli 可作为耐药基因来源。水貂相关E. coli 中出现共携带mcr-1.1与bla_CTX-M?55的可转移质粒，表明其跨细菌宿主持久存在与传播风险增加。需进一步研究阐明这些耐药基因的传播机制与进化特征。